丝素蛋白水凝胶的改性方法及其在骨组织工程中的应用

陈润智 张文涛 陈枫 杨帆

1.浙江中医药大学口腔医学院 杭州 310053；

2.浙江省人民医院（杭州医学院附属人民医院）牙科 杭州 310014；

3.浙江工业大学材料科学与工程学院 杭州 310014

由于创伤、肿瘤、手术等引起的骨缺损常导致人体功能障碍。在临床上，大面积骨缺损的修复再生仍是一项挑战。组织工程是将工程学原理和生命科学原理结合，以开发生物替代品为目标，将细胞、生长因子等与支架材料结合，创建3D骨组织替代物，用以指导新骨生成[1]。其核心是通过模拟宿主组织，创造一个适合细胞生长的微环境，该环境通常由多孔支架提供。常见的支架材料包括合成及天然聚合物、复合材料、生物陶瓷等[1]。

在天然聚合物中，应用较多的蛋白质支架有胶原支架、明胶支架以及丝素蛋白支架。胶原蛋白是动物体内最为丰富的蛋白质，也是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的关键组成部分。由于低成本、低免疫原性、良好的生物相容性等优势，以胶原蛋白为基质制备的水凝胶等生物材料已被广泛应用于组织工程的研究中[2]。然而，快速的降解速率导致其机械性能较弱，限制了胶原蛋白水凝胶在骨及软骨等具有一定机械强度的组织再生中的应用[2-3]。明胶具备更优秀的生物相容性与生物降解性，但依然存在机械强度较弱的问题，难以作为骨组织工程的承重支架[4]。相比之下，丝素蛋白（silk fibroin，SF）表现出较为出色的机械性能，丝素纤维的极限强度为300~740 MPa，韧性更是超越了一些合成纤维[5]。同时，SF也具有良好的生物相容性。自1993年起，SF就已被美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准作为生物材料[6]，后被广泛用于缝线材料及伤口敷料中。此外，SF是一种酶促降解聚合物，可在生理条件下被降解且降解速率可调。基于这些特点，SF受到组织工程领域研究者的广泛关注[7]。

理想的支架材料应具备良好的生物相容性，机械性能和降解速率应与目标组织相似，并具骨诱导和促进血管生成等能力。水凝胶是一种较为理想的支架材料[8]，不仅与天然ECM相似，还能与其他材料或活性分子结合，实现机械改性或化学改性。丝素蛋白水凝胶生物相容性佳，降解性能可调，然而其并非完美，纯丝素蛋白水凝胶机械性能不足，促细胞分化能力弱。要想其成为理想的骨支架材料，同时满足骨组织工程中的个性化要求，需要对丝素蛋白水凝胶进行改性。因此，本文将重点从提升水凝胶机械性能，增加水凝胶生物诱导作用，调节水凝胶生物降解性能等方面综述目前常用的丝素蛋白水凝胶改性方法的研究进展及其在骨组织工程中的应用。

1 丝素蛋白水凝胶的特性

ECM是主要由纤维结构蛋白、特殊蛋白和蛋白聚糖组成的复杂微环境，是多细胞生物的基本组成部分。ECM不仅为细胞和组织提供支持，并参与调控细胞命运，包括迁徙、增殖和分化等行为，在骨再生中发挥重要作用[9]。水凝胶是一类由天然或合成聚合物制备而成的3D网络结构，能模仿天然ECM，在组织工程领域有广泛应用[10]。

SF 总共由3 种蛋白质组成[11]，分别为350~390 kDa的重（H）链和26 kDa的轻（L）链，两者通过二硫键连接构成H-L复合物。其中，H链通过分子内及分子间作用力形成的β-折叠结构是SF力学性能的主要来源[12]。而L链相对更小，几乎不参与β-折叠结构的构成。

作为天然聚合物，SF被制备成水凝胶后仍具备良好的生物相容性，作为植入物时能较好支持周围组织细胞生长[13]。Etienne等[14]观察到在丝素蛋白水凝胶中培养的纤维母细胞的增殖率比胶原水凝胶中的更高，且无细胞凋亡。将水凝胶植入小鼠皮下后，炎症反应在4周后大大降低，至12周后完全消失。这表明丝素蛋白水凝胶很少引起长期的炎症反应。

丝素蛋白水凝胶的另一项优势是具有良好的生物降解性及生物可吸收性。将丝素蛋白水凝胶植入至大鼠体内后，约42 d后可降解完全[15]。其降解产物是以甘氨酸、丝氨酸等为主要成分的氨基酸[13]，可被人体完全吸收，几乎无害[16]。

但丝素蛋白水凝胶应用于骨组织修复时，仍存在一些缺陷。

1）即便SF中存在大量疏水氨基酸基团，如甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸等，且由于β-折叠结构的热力学稳定性[17]，使得SF能在不添加凝胶剂的情况下凝胶化。但自然条件下，凝胶过程缓慢，甚至可能耗费数月时间[18]，为水凝胶制备带来极大困难。

2）理想的骨组织工程支架需要具备与骨相似的机械性能，在愈合过程中抵抗周围软硬组织的力并维持其形态。皮质骨和松质骨的杨氏模量分别为15~20 GPa和0.1~2 GPa[19]。而单纯丝素蛋白水凝胶脆性大，机械性能不足，压缩模量仅为（30.9±7.6） kPa[20]，作为骨组织支架时难以满足强度要求。

3）促进成骨细胞分化的能力也是不可或缺的。对骨组织而言，促进血管生成也是一项重要因素，因为骨是高度血管化的组织，血液可以运输氧气、营养物质和代谢废物，这对维持成骨细胞骨基质合成与矿化至关重要[21]。但单纯丝素蛋白水凝胶缺乏引导细胞分化的生物线索[22]。

这些缺陷限制了丝素蛋白水凝胶在骨缺损修复中的应用，难以满足各种情况下对不同性能的要求。因此对丝素蛋白水凝胶的改性一直是研究探索的热点。

2 骨组织工程中丝素蛋白水凝胶的改性

2.1 SF凝胶化机制

丝素蛋白溶胶的凝胶化起源于分子间和分子内相互作用，包括疏水键和氢键，使得分子结构从无规则卷曲向β-折叠结构转变，最终形成凝胶。在蚕体内的自然纺丝过程，紧紧控制着SF疏水氨基酸的相互作用，从而控制β-折叠结构的形成和整体的结晶度，这种控制是通过位于疏水链段之间的亲水化学连接实现的。此外，这些连接基团也为蛋白质折叠和水溶性提供了链柔性[23]。Silk Ⅰ、Silk Ⅱ以及不稳定的Silk Ⅲ是SF的主要构象，存在于空气/水界面的SF溶液中。Silk Ⅰ是一种曲折非晶构象的亚稳态结构的正交晶系，只存在于丝腺中，由于存在一定数量的无规卷曲以及α-螺旋结构，而且Silk Ⅰ的结晶度最低，所以导致其稳定性和水溶性较差[24]。Silk Ⅱ是一种反平行并且属于单斜体系的β-折叠构象，由于这种结构的结晶度最高，所以其稳定性、耐热性、不溶于水性和力学性能得到有效提升[25]。外部刺激可以实现Silk Ⅰ结构到Silk Ⅱ结构的转化，如加入醇类溶液（甲醇或乙醇）或是紫外线的照射，对于免疫反应来说，Silk Ⅱ比Silk Ⅰ结构更加合适[26-27]。Silk Ⅲ是一个独特的结晶多形体结构，并且具有三倍螺旋晶体的结构，Silk Ⅲ的结晶度在Silk Ⅰ和Silk Ⅱ之间[28]。SF的生物响应性、免疫反应、生物降解性以及机械性能都被SF的结晶度大小以及构象转变所深刻影响[29]。其中，Silk Ⅱ的影响是最大的，对SF的生物学性能起着至关重要的作用。

Matsumoto 等[17]通过傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTⅠR）和圆二色性（circular dichroism，CD）光谱观察SF溶液凝胶化的过程，并将凝胶过程分为以下几个阶段：1）凝胶化早期阶段（二级结构≤15%），主要存在氢键、疏水相互作用和静电相互作用，此阶段凝胶化过程是可逆的，不发生二级结构的改变，因此也未形成β-折叠结构；2）凝胶化晚期阶段（二级结构＞15%），β-折叠结构的数目随凝胶化进程呈线性增加，最终达到稳定且不可逆的凝胶状态。

2.2 丝素蛋白水凝胶机械性能提升

2.2.1双网络（double network，DN）结构 水凝胶机械性能的提高通常与DN结构有关。DN结构的概念于2003年被提出[30]，DN结构中2个网络性质不同，一个网络交联程度高，硬度更高；另一个网络交联程度低，硬度较低但柔韧性更高。受外界应力时，刚性网络优先断裂，耗散部分能量，即为“牺牲键”；而柔性网络中大分子相互纠缠，防止裂纹扩散，维持了凝胶外形。

有研究将甲基丙烯酸酐在透明质酸（hyaluronic acid，HA）分子链上接枝得到的衍生物甲基丙烯酸透明质酸（methacrylated hyaluronic acid，HAMA）作为第二网络引入水凝胶。制备出的SFHAMA双网络水凝胶表现出较佳的机械性能，在压缩性能测试中，强度最高的双网络水凝胶与纯丝素蛋白水凝胶相比，压缩模量增加了近5倍[31]。HAMA的加入还改变了原凝胶的孔隙率，使复合凝胶能较好支持小鼠胚胎成骨细胞（MC3T3-E1）的黏附和生长。也有学者使用十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）诱导高浓度的再生丝素（regenerated silk fibroin，RSF）溶液转变为凝胶，即为第一网络，再使用聚硬脂基丙烯酸酯[poly(stearyl acrylate)，PSA]与聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAM）形成第二网络。与单一网络水凝胶相比，该水凝胶表现出更佳的强度与韧性[32]。

2.2.2互穿网络结构 除DN外，还能通过2种及以上相互独立交联的聚合物形成互穿网络（interpenetrating network，ⅠPN）来提升水凝胶的机械性能。

如将天然聚合物明胶在微生物转谷氨酰胺酶（microbial transglutaminase，mTG）的作用下共价交联，再使用90%乙醇诱导SF进行物理交联可得到单层ⅠPN水凝胶。在此基础上，将冻干后的ⅠPN水凝胶置于在明胶-丝素纤维素混合物重复双交联过程，获得双层ⅠPN水凝胶。后续实验证明：单层ⅠPN水凝胶机械性能远超纯丝素蛋白水凝胶，在50%应变时，压缩模量提升至848 kPa。双层ⅠPN水凝胶在同样的50%应变下具有1.56 GPa的压缩模量[33]。

2.2.3纳米复合水凝胶 Haraguchi等[34]提出的纳米复合水凝胶也为高强度水凝胶的制备提供了新思路。

例如，将结合二氧化硅纳米颗粒（silica nanoparticle，SiNP）的丝素蛋白纳米纤维（silica nanoparticles-distributed-silk fibroin nanofiber，SiNP@NF）引入丝素蛋白水凝胶。当加入质量分数为5%的SiNP@NF时，复合凝胶的压缩模量可由纯丝素蛋白水凝胶的（30.9±7.6） kPa 提升到（234.6±38.1） kPa，一定程度上缩小了与天然骨组织之间的机械性能差距，也使复合凝胶具备了优秀的骨诱导能力[20]。

2.2.4物理/化学交联 利用物理、化学交联或双交联也能提升水凝胶的机械性能[35-36]。物理交联中不添加任何化学交联剂，只通过改变特定的物理条件，如调节温度、pH值，添加非溶剂和表面活性剂[37-40]等；或通过特定方法，如超声、漩涡等方法[41-42]，均以非共价键诱导SF分子从无规则卷曲结构转变为β-折叠结构。化学交联则应用各种交联剂，使SF分子通过化学键相互连接，进而形成稳定的网络结构，常见的交联剂有戊二醛、京尼平等，或应用光交联、酶促反应等。

自然状态下SF的凝胶时间长，凝胶强度弱，通过物理或化学交联能同时改善这2个缺陷。如将乙二醇二缩水甘油醚（ethylene glycol diglycidyl ether，EGDE）添加入SF溶液后，EGDE会与精氨酸和赖氨酸交联，限制丝素蛋白链的活动，从而促进β-折叠结构的形成，最终将凝胶时间缩短至2 h且形成的凝胶弹性模量最高可达3 kPa[43]。

此外，低温/冷冻交联借助于低温的可挤压性以及SF孔壁之间的摩擦力，可以耗散水凝胶的能量[44]，是一种有效提升凝胶机械性能的方法。但相对来说，物理交联的丝素蛋白水凝胶力学性能较弱。Lu等[45]的实验也证实了这一点，在他们的实验中，双交联的方法使水凝胶的压缩强度由（0.29±0.11） MPa提升到（0.88±0.03） MPa，而物理交联者为（0.42±0.10） MPa。

2.3 丝素蛋白水凝胶生物诱导作用

2.3.1添加生长因子 促进细胞分化可通过添加各种生长因子实现，其中以转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β家族的各种骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）最为多见。水凝胶作为递送系统时，可在一定时间内实现生长因子的缓慢释放[46]，在临床上有广泛应用。

有研究[47]将静电纺丝聚己内酯（polycaprolactone，PCL）纳米纤维网管和丝素蛋白水凝胶结合组成递送系统，在大鼠股骨临界缺损模型中，证实了该系统递送BMP -2对促进骨形成的有效性。另有学者[48]进一步在丝素蛋白水凝胶中添加纳米羟磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHA）-氧化石墨烯（graphene oxide，GO）混合纳米填料，利用纳米填料的多孔结构将BMP-2固定在水凝胶上，在体外实验中表现出优秀的促成骨能力。

2.3.2添加活性离子或活性分子 添加活性离子也可达到促细胞分化的目的，如铜离子可诱导内皮生长因子的表达和促进血管生成[49]；钴离子可上调血管内皮生成生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达[50]；钙离子、锌离子、硅离子等可促进骨细胞分化等[51-52]。

有学者通过铜离子诱导血管生成，协同生物活性玻璃纳米颗粒（bioactive glass nanoparticles，BGNP）释放的钙、硅离子刺激成骨的作用，制备出了兼具两者优势的复合凝胶，并在凝胶中接种MC3T3-E1与人脐静脉内皮细胞，分别检测成骨相关基因ALP的活性与成血管相关基因标志物的表达，结果显示：相比于对照组，复合凝胶组各项基因表达最为活跃。动物实验中，观察到8周后实验组大鼠颅骨缺损几乎完全修复，且缺损区骨小梁数量及厚度均为最高。这进一步证实了复合凝胶的优势，即该凝胶不需要额外添加生长因子，便同时具备促成骨及成血管功能[53]。

活性分子如外泌体，也显示出良好的骨诱导性能[54]。Yan等[22]选用了一种小肽凝胶剂（NapFFRGD），设计出一种生物官能水凝胶SF-RGD。RGD配体的引入，不仅减少了凝胶时间和阈值凝胶浓度，还促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化，在小鼠颅骨缺损模型中表现出良好的骨再生能力。

2.3.3改变表面微观结构 一些特定的物理化学性质如表面微观结构也会影响细胞命运[55]。如在水凝胶中添加纳米材料，与传统微孔材料相比，纳米材料具有促进细胞黏附和增殖的能力。其中，羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人体骨骼的主要成分，具有诱导细胞成骨分化的能力。在丝素蛋白水凝胶中添加nHA后，与单纯丝素蛋白水凝胶相比，复合凝胶促进成骨的能力加强[56]。

适宜的孔隙率与孔径也十分重要。用于成骨的支架材料的最佳孔隙率为50%~90%，最佳孔径为300 μm[57]。有研究先结合3D打印技术与单向冷冻铸造技术，赋予硅-丝素杂化凝胶层次化的多孔结构，再利用含RGD序列的抗微生物肽对其表面进行修饰。在电子显微镜下可以观察到该支架微观形态发生显著变化，不仅能较好地支持MC3T3 E1细胞地生长和增殖，也能在短时间内于表面形成HA，引导HA结晶在支架表面生长，表明其良好的骨诱导与骨引导性能[58]。

2.4 丝素蛋白水凝胶生物降解性能调节

在体内，SF的降解行为由异物反应介导[59]；在体外，多种酶如糜蛋白酶[60]、蛋白酶XⅠV[61]、金属蛋白酶[62]等被证明可参与降解丝素。丝素材料的降解速率取决于二级结构的数量，另外，丝素溶液浓度[63]、加工条件、植入材料位置、降解酶的类型及浓度[61]、交联方式[64-65]等多种因素也会影响其降解速率。如在一项关于丝素-果胶复合凝胶的研究[66]中，可以观察到随着果胶浓度升高，复合凝胶的降解速率加快，这是由于果胶的存在抑制了丝素纤维的结晶，加强了酶降解性；并且在不同酶的降解下，凝胶的质量损失有所不同。

有学者[67]研究了不同脱胶时间对酶交联的丝素蛋白水凝胶材料特性的影响，结果显示：缩短脱胶时间会降低凝胶的降解速率，降低凝胶的溶胀；同时，促进β-折叠结构的形成，使凝胶机械强度增加。

与其他材料的结合也会影响丝素蛋白水凝胶的降解速率。Meng等[68]将甲基丙烯酸硬脂酸酯（stearyl methacrylate，C18M）与SF结合，制备了基于SF的疏水缔合水凝胶，在磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）及蛋白酶XⅠV溶液中进行降解测试，观察到了相似的结果，即C18M的加入均减缓了SF的降解，且复合凝胶的降解率随C18M浓度的增加而降低。如在缓慢降解的RSF中引入较快降解的明胶（gelatin，G），制备出的RSF/G水凝胶降解速率则会在两者之间，并可通过改变RSF含量调节水凝胶的降解时间，使之与大鼠的颅骨缺损愈合时间相匹配[69]。

3 结论与展望

丝素蛋白水凝胶由于其良好的生物相容性，稳定的物理化学特性，在工程领域有广泛应用。虽然单纯丝素蛋白水凝胶不能完全满足骨组织工程的要求，但通过改进水凝胶的成胶体系、凝胶结构等，能大幅弥补单纯丝素蛋白水凝胶在机械性能、促组织分化等方面的不足；并且，丝素蛋白水凝胶的制备已从单一的交联方式发展为多种交联方式联用，制备出的凝胶是满足多种要求的功能化丝素蛋白水凝胶，这对拓宽丝素蛋白水凝胶的应用范围至关重要。

目前，丝素蛋白水凝胶的功能化仍处于起步阶段，虽然现在已开发出机械性能佳、降解性佳、能促细胞分化的功能化水凝胶，但仍难以满足复杂应用环境的需求。多数体内实验止步于小动物实验，临床应用较少。体外研究多聚焦于成骨分化，在此基础上，可以借助丝素蛋白水凝胶与3D共培养系统，模拟体内环境，构建类似于骨骼的复杂动态模型。

与此同时，水凝胶的3D打印技术方兴未艾，如何基于丝素蛋白凝胶前驱体，开发喷墨打印、光固化打印的生物基水凝胶材料，对于SF的临床应用具有重大的使用价值。

因此，有待于更深入地了解SF的各项性能、探索更多改性可能，构建出更符合骨组织工程要求的生物学材料，为临床提供新的理论依据。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。