TLR4/MyD88非依赖信号通路在强直性脊柱炎患者中的表达及临床意义

杨大伟,臧欢欢,杨慧敏,孙 旭,李 莹,袁伶俐

(1.蚌埠医学院第二附属医院风湿免疫科,安徽 蚌埠 233000;2.蚌埠医学院第一附属医院儿科,安徽 蚌埠 233004;3.蚌埠医学院第二附属医院骨科,安徽 蚌埠 233000)

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性自身炎症性疾病,以中轴关节受累为主,主要累及骶髂关节、脊柱骨样突、脊柱旁软组织等,也可伴有关节外表现(如葡萄膜炎或虹膜炎),严重时可发生脊柱畸形和关节强直[1-2],对患者生活质量造成很大影响。但AS的病因和发病机制目前仍不十分明确。有研究表明,γ-干扰素(IFN-γ)与多种自身炎症和免疫疾病相关,如免疫球蛋白A肾病、多发性硬化症等[3-4]。也有研究表明,在中国汉族人群中IFN-γrs2069727基因多态性与AS起病显著相关[5]。袁跃兴等[6]发现,AS患者血清IFN-γ表达水平显著升高,且与C 反应蛋白(CRP)呈正相关。提示IFN-γ可能作为致炎因子参与了AS的起病及病情活动。而IFN-γ为细胞Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)非依赖信号通路重要的末端炎症因子[7],提示TLR4/MyD88非依赖信号通路也可能参与了AS的发生。本研究通过检测AS患者血清及滑膜组织TLR4/MyD88非依赖信号通路中重要上游节点分子——TLR4、Toll样受体相关分子(TRAM)、TIR域含适配器诱导β-干扰素(TRIF)、核因子-κB(NF-κB)及末端炎症因子——IFN-γ的表达,探讨了TLR4/MyD88非依赖信号通路在AS起病及病情活动中所起的作用,旨在为治疗AS提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 (1)试验1:选取2019年1月至2021年12月在蚌埠医学院第二附属医院风湿免疫科就诊的AS患者46 例作为AS组,其中男31 例,女15例;年龄15～61岁,平均(37.50±11.19)岁;平均身高(169.76±5.59)cm;平均体重指数(23.06±2.35)kg/m2。选取同期健康体检者30例为健康对照组,其中男25例,女5例;年龄27～57 岁,平均(38.90±7.70)岁;平均身高(171.43±5.37)cm;平均体重指数(23.85±1.57)kg/m2。2组研究对象性别、年龄、身高、体重指数比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)试验2:选取13例行髋关节置换术AS患者滑膜组织作为AS手术组,其中男9例,女4例;年龄36～56岁,平均(47.53±7.16)岁;平均身高(169.15±5.79)cm,平均体重指数(23.85±1.83)kg/m2。选取10例同期髋关节创伤性骨折患者滑膜组织作为对照组,其中男7例,女3例;年龄28～56岁,平均(42.0±8.79);平均身高(168.8±4.59)cm;平均体重指数(24.22±1.85)kg/m2。2组患者性别、年龄、身高、体重指数比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。AS手术组及对照组滑膜组织均为患者手术时取得。本研究经医院伦理委员会审批(伦理编号:蚌埠医学院伦科批字[2021]第247号)。样本收集均取得研究对象知情同意,均签署本研究知情同意书。

1.2方法

1.2.1血清红细胞沉降率(ESR)、CRP、 IFN-γ检测 ESR、CRP均于蚌埠医学院第二附属医院检验科完成检测。IFN-γ酶联免疫吸附试验检测试剂盒购自深圳子科生物科技有限公司(货号:ZK-H1171),严格按试剂盒说明书进行操作。

1.2.2AS病情活动度评分(ASDAS)-CRP 采取ASDAS-CRP评价AS疾病活动度。ASDAS-CRP=0.12×腰背痛+0.06×晨僵持续时间+0.1×患者总体评价+0.07×外周关节疼痛/肿胀+0.58×Ln(CRP+1)。腰背痛、晨僵持续时间、患者总体评价、外周关节疼痛/肿胀均采用疼痛视觉模拟疼痛量表进行评价,0分为不存在不适感,10分为严重不适。ASDAS作为新型AS疾病活动度指标由国际脊柱关节炎评价工作组于2009年首先提出[8]。

1.2.3TLR4 /MyD88非依赖信号通路相关分子mRNA表达水平测定 采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法测定TLR4/MyD88非依赖信号通路相关分子mRNA表达水平。严格按RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA,逆转录合成cDNA,用TP800 PCR扩增仪按实时荧光定量PCR说明书采用探针法对cDNA进行PCR检测、扩增,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,以95 ℃预变性30 s,然后进行循环扩增,95 ℃变性5 s,60 ℃退火加延伸30 s,共40个循环,反应结束后进行溶解曲线分析。RNA抽提试剂盒(Code No.9767)、反转录试剂盒(Code No.RR036A)、实时荧光定量PCR检测试剂盒(Code No.RR391A)、荧光定量PCR扩增仪(TP800)均购自日本TaKaRa公司,TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ、内参GAPDH引物均由上海生物工程技术服务有限公司设计合成。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达水平。各信号分子引物见表1。

表1 各信号分子引物

2 结 果

2.12组研究对象血清ESR、CRP、IFN-γ水平比较 AS组患者血清ESR、CRP、IFN-γ水平均明显高于健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组研究对象血清ESR、CRP、IFN-γ水平比较

2.2AS患者血清IFN-γ水平与CRP、ESR、ASDAS-CRP 的相关性 AS患者血清IFN-γ水平与ESR、CRP、ASDAS-CRP水平均呈正相关(r=0.762、0.776、0.405,P<0.001、<0.001、0.005)。

2.32组患者滑膜组织TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA表达水平比较 与对照组滑膜组织比较,AS手术组患者滑膜组织TLR4/MyD88非依赖信号通路重要节点分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA 表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

3 讨 论

TLR4是膜蛋白家族中的一员,可识别不同病原体的病原相关分子模式(包括格兰阴性菌脂多糖、热休克蛋白、磷壁酸等),激活体内胞内信号通路,并诱发免疫相关基因和促炎基因的表达,引起炎性反应。根据是否需要MyD88分子介导分为MyD88依赖和MyD88非依赖两种信号通路。TLR4经MyD88依赖通路诱发肿瘤坏死因子-α的释放,引起早期炎性反应,而经Myd88非依赖通路则激活晚期NF-κB和干扰素调节因子3(IRF-3)的转录。有研究表明,TRAM特异性介导了TLR4/MyD88非依赖信号通路,是激活TRIF,活化IRF3、NF-κB信号蛋白必不可少的重要衔接分子,而对TLRs中的其他受体无作用[9]。NF-κB是调控细胞增殖、凋亡、恶性转化及浸润的重要的核转录因子,当细胞受到炎性细胞因子刺激后激活κB抑制因子激酶(IKK)复合体等特定的蛋白激酶,κB抑制因子磷酸化、泛素化后立即被蛋白酶体降解,导致NF-κB释放,核易位进入细胞核,启动相关基因的转录[10]。在TLR4/MyD88非依赖信号通路中TLR4通过TRAM激活TRIF,TRIF与接头蛋白募集肿瘤坏死因子受体相关因子6绑定,使下游TRNK结合激酶1分子磷酸化,TRNK结合激酶1紧接着激活丝裂原激活的蛋白激酶和NF-κB,而NF-κB 可激活IRF3[7,9,11],释放大量IFN-γ,而IFN-γ作为TLR4/MyD88非依赖信号通路重要的末端炎症因子具有多种生物学作用:(1)可激活巨噬细胞、内皮细胞、淋巴细胞等一系列具有免疫活性的细胞,并促进其功能。(2)也可促进包括抗原呈递细胞在内的多种细胞表达主要组织相容性复合体Ⅰ类分子和Ⅱ类分子[12]。(3)促进辅助性T淋巴细胞0分化为辅助性T淋巴细胞1,并抑止辅助性T淋巴细胞2增殖。(4)促进细胞毒性T淋巴细胞成熟及活化。(5)促进B淋巴细胞分化,产生抗体及免疫球蛋白类型转化;此外,其还可通过上调某些趋化因子和自身受体的表达,降低上皮细胞屏障功能,促进中性粒细胞迁移,引发炎性反应[13]。

钦丹萍等[14]研究表明,在三硝基苯磺酸/乙醇联合灌肠的方法建立三硝基苯磺酸 /乙醇溃疡性结肠炎大鼠模型的肠黏膜中TLR4 /MyD88非依赖信号通路相关分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB、IFN-γ无论在mRNA 还是蛋白表达水平均明显高于健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。提示MyD88非依赖信号通路参与了溃疡性结肠炎大鼠炎症活动的调控。同时,也有研究表明,IFN-γ在炎症性肠病患者肠黏膜上的表达也明显增加[15]。DOLHAIN等[16]发现,类风湿关节炎(RA)患者血清及滑膜组织IFN-γ水平明显高于骨性关节炎患者,差异有统计学意义(P<0.05)。MANOURY-SCHWARTZ等[17]对RA小鼠模型研究发现,IFN-γ可损伤关节,引起关节炎症,RA小鼠注射IFN-γ单抗后不仅能减轻关节炎程度,还能降低关节炎发生率。付晓敏等[18]应用免疫组织化学方法对AS 患者滑膜组织TLR4及其信号通路中主要分子,如MyD88、NF-κB-p65 进行检测发现,AS患者滑膜组织TLR4、NF-κB-p65表达阳性,MyD88表达阴性,提示经由TLR4/MyD88非依赖信号通路引起免疫炎性反应,从而参与了AS发病及病情活动。

本研究结果显示,AS患者血清IFN-γ水平明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且IFN-γ与CRP、ASDAS-CRP均呈正相关,提示IFN-γ可能作为促炎性细胞因子参与了AS发病及病情活动。本研究进一步对AS患者滑膜组织TLR4/MyD88非依赖信号通路中的重要上游节点分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65及末端炎症因子——IFN-γ检测结果显示,与对照组比较,AS手术组患者滑膜组织TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。

综上所述,TLR4/MyD88非依赖信号通路可能在AS起病及病情活动中起到重要作用。后期将进一步通过免疫组织化学及Western blot等方法检测AS患者治疗前后TLR4/MyD88非依赖信号通路相关分子表达情况,为TLR4/MyD88非依赖信号通路参与AS起病及病情活动提供更充分的证据,从而为治疗AS提供新思路。