陕西黄瓜靶斑病菌鉴定及药剂毒力测定

李新阳,李 敏,刘海龙,罗桢彬,王 阳,马 青

(1.西北农林科技大学 植物保护学院,陕西杨凌 712100;2.陕西省铜川市蔬菜技术推广站,陕西铜川 727000;3.陕西省甘泉县蔬菜技术服务中心,陕西甘泉 716100)

黄瓜靶斑病俗称黄点子病,又称褐斑病。由多主棒孢霉(Corynesporacassiicola)引起,主要危害黄瓜叶片,发生严重时危害茎蔓、叶柄。多主棒孢霉寄主范围广,可侵染包括橡胶、番茄、大豆等380个属内530种植物[1]。多主棒孢霉以分生孢子随病残体、杂草在土壤中或寄主上越冬,或以菌核、厚垣孢子形式越冬,适宜温度下产生分生孢子;翌年,病菌通过气流、雨水飞溅传播后完成初侵染,潜伏期约一周,后形成新的分生孢子进行多次再侵染,扩散迅速。黄瓜靶斑病的病情消长与温室内小气候的变化呈显著的相关关系,尤其病原菌可在保护地内安全越夏的情况下,导致保护地内黄瓜靶斑病多年持续发生[2-3]。该病发生于盛瓜期,有时苗期也可发生,通常中部叶片最先发病,后逐渐向下部扩展,常造成减产20%以上,重则达到70%,甚至绝收,严重影响黄瓜的品质与产量[4-5]。本研究采用生长速率法[6]测定10种杀菌剂对黄瓜靶斑病菌的室内毒力效果,研究多种药剂对黄瓜靶斑病菌皿内生长的抑制效果,以期为开发防治黄瓜靶斑病的新药剂和科学合理使用杀菌剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

由西北农林科技大学植物保护学院蔬菜病害及生物防治实验室于陕西延安地区大田内病害重发区采样分离获得,编号20190601。经纯化后, 4 ℃保存于PDA培养基斜面上,备用。

1.2 供试药剂

供试药剂的名称、有效成分含量、毒性及生产厂家见表1。

表1 供试药剂Table 1 Fungicides for test

1.3 培养基

PDA培养基(马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂糖15～20 g),121 ℃灭菌30 min,供菌株活化培养与后续试验使用。含药培养基(原药的含药培养基制备需使用有机溶剂,将原药用丙酮溶解,0.01 g原粉中加入1 mL丙酮制成浓度为10 mg/mL的母液,备用)。

1.4 病原菌形态学鉴定

从接种后发病的植株叶片上分离病原菌,分离物于PDA平板上培养,28 ℃恒温培养7 d,为确定分离获得的病原为多主棒孢霉,观察培养基生长的菌落形态、培养形状,并利用显微镜观察其分生孢子、分生孢子梗、菌丝体等形态特征。

1.5 病原菌分子生物学鉴定

利用真菌rDNA-ITS特异性引物对分离菌株核糖体内转录间隔区进行扩增。

上游引物:ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′; 下游引物:ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

首先利用真菌基因组提取试剂盒提取黄瓜靶斑病菌基因组。其次进行rDNA-ITS序列的PCR扩增,扩增体系:2×Reaction Mix 9.5 μL,ddH2O 12.5 μL,正反向引物各1 μL,模板DNA 1 μL;扩增条件:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性 30 s,58.5 ℃退火90 s,72 ℃延伸30 s,35个循环,72 ℃ 10 min。第三步进行PCR产物电泳检测。第四为扩增片段送测序。第五步作序列比对:将测序结果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)中进行Blastn比对。第六步利用MEGA X 10.1.8,基于rDNA-ITS序列构建NJ(Neighbor-Joining,邻接法)系统发育树,Bootstrap值为1 000。

1.6 杀菌剂对黄瓜靶斑病菌的毒力测定

1.6.1 菌株的活化 将供试菌株转接到PDA培养平板上于28 ℃无光照条件下进行活化培养,7～8 d后待菌丝长满整个培养基时用于后续 试验。

1.6.2 不同浓度药剂PDA平板制备 根据前期预备试验所得结果,将原药母液及各种单剂、复配剂稀释成适宜的5个梯度浓度的药剂稀释液。吸取1 mL药液并加入9 mL融化后冷却至50～60 ℃的PDA培养基在培养皿内摇匀,使之凝固。由此得到包含5个梯度浓度的含药培养基。以无菌水作空白对照,每个处理设置3次重复。

1.6.3 不同药剂抑菌效果测定 菌株实现活化后,取0.5 cm菌饼转接到上述的含梯度浓度药剂和空白对照的PDA培养平板中。28 ℃倒置培养7～8 d。待对照中菌落覆盖整个平板时,采用十字交叉法测量各处理菌落直径。

整理数据并计算各处理所测菌落直径均值。根据(1)式得到各菌落净增长直径,根据(2)式计算各处理相对应的抑制率。以药剂浓度的对数值为横坐标,抑制率为纵坐标,使用DPS 7.05 软件处理系统计算11种杀菌剂对黄瓜靶斑病菌毒力回归方程、相关系数、EC50及其95%置信限。

菌落直径(d) = 测量菌落直径平均值-0.5

(1)

抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%

(2)

1.7 孢子悬浮液制备

将已完成活化培养的菌株加入无菌水,用接种环在培养基表面轻轻摩擦,使分生孢子悬浮于蒸馏水中。然后3层纱布过滤除去菌丝。孢子浓度调至低倍镜下每个视野约20个分生孢子。

1.8 不同药剂对分生孢子萌发的影响

根据皿内抑菌试验,选择最优的药剂用无菌水稀释成0.12、0.24、0.48、0.96、1.92 mg/L,并设置空白对照。处理药剂与孢子悬液按1∶1的体积比混合。用滴管吸取融化后的WA培养基于载玻片上,待凝固后,用移液枪吸取20 μL各处理药剂滴于载玻片上,置于保湿培养箱中,黑暗条件下培养一段时间进行后续观察。当对照组孢子萌发率达到90%以上时,统计各处理孢子萌发情况。以孢子芽管长度大于孢子长度一半时视为萌发。每个处理3次重复。调查各处理孢子总数不少于100个。记录孢子萌发数及孢子总数,计算药剂对孢子萌发的抑制率。

抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%

(3)

2 结果与分析

2.1 形态特征鉴定

显微镜观察见图1所示,分生孢子多单生于分生孢子梗上,呈倒棍棒形或圆柱形,浅褐色至褐色,直立或略弯曲,不分支,分隔1至多个,长度约为30～300 μm,宽度约为10 μm。菌丝无色,具分支与隔膜。分生孢子梗直立或略微弯曲,不分支,具隔膜,有时基部呈现膨大状。

菌落形态见图2,28 ℃下在PDA培养基中暗培养7 d菌落直径可达75 mm。生长均匀,菌落呈辐射状展开,生长致密,向上隆起;随着培养时间的增加,菌落颜色逐渐变深,一般中央呈黄褐色,边缘呈白色;菌落圆形,边缘整齐;无色素 泌出。

通过对靶斑病菌菌丝、分生孢子、分生孢子梗等形态的观察以及菌落在PDA培养基上的培养特性的描述,经鉴定与文献中报道的关于黄瓜靶斑病菌的描述一致,确定引起陕西地区黄瓜靶斑病的病原菌为多主棒孢霉(C.cassiicola)。

2.2 分子生物学鉴定

分离纯化后的菌株20190601经rDNA-ITS序列PCR扩增后,得到大小在500～750 bp的片段(图3)。将扩增产物测序后获得大小为564 bp的片段,经BLAST进行同源序列比较,结果表明分离菌株与多个Corynesporacassiicola菌株相似性大于99%。基于rDNA-ITS区构建系统发育树(图4)。在bootstrap重复1 000次的基础上,菌株20190601与C.cassiicola(MG976657.1,JN034677.1)以99%自举值聚在同一分支,进化距离最接近,基于此确定分离菌株为多主棒孢霉(C.cassiicola)。

图3 菌株20190601 rDNA-ITS序列PCR鉴定Fig.3 PCR identification of rDNA-ITS of strain 20190601

图4 基于邻接法构建菌株20190601与21种相关菌株的ITS序列系统发育树Fig.4 Construction of phylogenetic tree for rDNA-ITS of strain 20190601 and other 21 related strains based on neighbor-joining method

2.3 不同杀菌剂对黄瓜靶斑病菌室内毒力测定

在第8天对照组靶斑病长满整个培养基时,统计数据。由表2可知,各药剂之间对黄瓜靶斑病菌菌丝生长的抑制效果差异明显。甾醇抑制剂类杀菌剂(咪鲜胺)对菌丝生长抑制作用最为显著,EC50为0.124 6 mg/L;三唑类杀菌剂(苯醚甲环唑和氟硅唑)以及两种复配剂(苯甲·吡唑酯和氟酰羟·苯甲唑)对靶斑病菌丝生长有较强的抑制作用,EC50介于1.793 6到3.343 8 mg/L;苯甲·嘧菌酯与戊唑醇对靶斑病菌皿内抑制效果良好,EC50介于20.572 2到25.960 1 mg/L;抗生素类(多抗霉素)、甲氧基丙烯酸酯类(吡唑醚菌酯)杀菌剂皿内抑制作用效果不显著,EC50介于183.980 5到241.261 8 mg/L;而露娜森(氟菌·肟菌酯)对黄瓜靶斑病菌的皿内抑制效果较差。

表2 10种杀菌剂对黄瓜靶斑病菌毒力Table 2 Toxicity test of 10 fungicides against C.cassiicola

2.4 咪鲜胺对黄瓜靶斑病菌孢子萌发的影响

第2天对照组孢子萌发率达到90%以上时,统计各组孢子萌发率。由表3可知,咪鲜胺对黄瓜靶斑病菌孢子萌发的抑制作用随着药剂浓度的增大而加强。根据上述(3)式计算各处理组相对应的抑制孢子萌发率。以药剂浓度对数值为横坐标,抑制孢子萌发率为纵坐标,使用DPS 7.05 软件处理系统求得毒力作用结果。分析结果可知,咪鲜胺对黄瓜靶斑病菌菌丝生长与孢子萌发均具有较强的抑制作用(表4)。另外,咪鲜胺对孢子形态结构的影响表现在孢子萌发过程中芽管局部发生膨大(图5)。

图5 0.96 mg/L咪鲜胺处理20 h后黄瓜靶斑病菌分生孢子形态Fig.5 Abnormality of conidiospore of C.cassiicola treated with 0.96 mg/L of Prochloraz for 20 h

表3 96%咪鲜胺对黄瓜靶斑病菌孢子萌发的抑制作用Table 3 Effect of prochloraz 96% on C.cassiicola conidial germination

表4 96%咪鲜胺对黄瓜靶斑病菌孢子萌发毒力Table 4 Toxicity test of prochloraz 96% to conidial germination of C.cassiicola

3 结论与讨论

目前,已正式登记用于防治黄瓜靶斑病的药剂多以苯甲·咪鲜胺、咪鲜胺和露娜森等[7],在黄瓜产区具有良好的防治效果。本研究通过对黄瓜靶斑病菌进行室内毒力测定,筛选7种对黄瓜靶斑病菌有较高毒力的杀菌剂。其中咪鲜胺对黄瓜靶斑病菌的毒力测定结果与迟晓红等[6]及徐丽慧等[8]报道较为一致;苯醚甲环唑和戊唑醇对黄瓜靶斑病菌的毒力测定结果与徐丽慧等[8]、张乃楼等[9]测定结果相差无几,但本试验所测戊唑醇EC50值相对较高,可能与菌株地理来源不同有关;张乃楼等[9]报道辽宁省各供试菌株对单一药剂(戊唑醇或苯醚甲环唑)敏感性表现整体一致,无显著差异,但存在敏感性降低的菌株。也有学者报道黄瓜靶斑病菌株对药剂的敏感程度与其地理来源并不明显相关,但对同一省内不同地区而言,病原菌对药剂毒力的抗性反应可指导其黄瓜生产过程中的合理用药。刘卫民等[10]报道 42.8%氟菌·肟菌酯SC对黄瓜靶斑病的防治效果,施药一周后防效可达81.3%。本研究经多次试验,发现43%氟菌·肟菌酯SC对黄瓜靶斑病菌皿内生长抑制效果不明显,可能已产生抗药性。