等温扩增荧光技术快速检测沙门氏菌的研究

梁振瑞 张薇 许绍坤 李鲜鲜 冯红 自武全

摘 要：本文研究并建立等温扩增荧光技术快速检测沙门氏菌的方法。通过对沙门氏菌的SSAQ基因序列保守区设计引物，采用最佳引物组搭配其他配套试剂建立一种针对沙门氏菌的等温扩增荧光技术快速检测方法；采用直扩法提取DNA，通过等温扩增荧光技术与常规PCR法对不同浓度沙门氏菌进行扩增检测，检测最低检测限，对其灵敏度进行评价。结果表明，所建立的针对沙门氏菌等温扩增荧光检测的方法与常规PCR法相比，等温扩增荧光检测的方法灵敏度更高，且根据干扰实验结果可知该方法對沙门氏菌具有良好的特异性，所建立的针对沙门氏菌的等温扩增荧光技术检测方法具有操作快捷、简便、反应时间较短、良好的特异性和较高的灵敏度的特点，能够用于沙门氏菌的快速检测。

关键词：等温扩增荧光技术；沙门氏菌；特异性；灵敏度

Abstract： A method for rapid detection of Salmonella by isothermal amplification fluorescence was developed. By designing primers for the conserved region of SSAQ gene sequence of Salmonella， an isothermal amplification fluorescence method for rapid detection of Salmonella was established by combining the best primers with other supporting reagents. The direct expansion method was used to extract DNA， and the isothermal amplification fluorescence technique and conventional PCR method were used to detect Salmonella with different concentrations. The minimum detection limit was detected， and the sensitivity was evaluated. The results showed that the established method for isothermal fluorescence amplification detection of Salmonella is more sensitive than the conventional PCR method， and it has good specificity for Salmonella based on interfering experimental results. The characteristics of this method are fast， simple， short reaction time， good specificity， and high sensitivity. It can be used for rapid detection of Salmonella.

Keywords： isothermal fluorescence amplification technology; Salmonella; specificity; sensitivity

沙门氏菌是革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科，是常见的食源性致病菌，目前已知血清型有2 500个以上[1-3]。人一旦摄入了含有大量沙门氏菌的食品，就会引起细菌性感染，进而导致食物中毒、急性肠胃炎等疾病，因此，沙门氏菌检测是各个国家检验机构的必检项目之一[4]。目前，检测沙门氏菌的方法有很多，如酶联免疫法[5]、PCR法等[6]，但这些检测方法都存在检测过程烦琐、检测周期长的弊端[7]。近年来，随着新技术的不断发展与完善，以分子生物学技术为基础的分析检测方法迅速发展[8-9]。因此，建立一种快速简便的沙门氏菌检测方法具有重要意义。

等温扩增荧光技术是核酸等温扩增和荧光技术结合的新型核酸诊断POCT技术，针对目的片段设计4～6条特异引物。使用DNA聚合酶，通过添加荧光染料实时监控整个扩增过程，分析实时扩增曲线和产物熔解曲线对产物进行定性或半定量。等温扩增荧光技术对温度精准度要求低，只需要恒定温度就能完成扩增反应，不需要预先进行双链DNA的变性，大大缩短了反应时间。由于该方法具有操作简单、反应快速、灵敏度和特异性强等优势，已被广泛用于病原体的快速检测。

1 材料与方法

1.1 病原菌

沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌、恶臭假单胞菌（简称：SM、DC、JP、ZH、EC）由云南国际旅行卫生保健中心（昆明海关口岸门诊部）提供。

1.2 主要仪器

电泳仪、电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶成像仪、OPG GENIE Ⅱ系统等温扩增荧光系统（OptiGene公司）、恒温水浴锅、大龙移液器等。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

采用菌液直接扩增法提取DNA，按1∶1的比例加入裂解液与菌液混合，95 ℃水浴或金属浴加热5 min，备用。

1.3.2 引物的设计

利用美国NCBI提供的BLAST在线软件分析沙门氏菌中的SSAQ基因目标序列，结合快速荧光PCR法对目标片段的要求，筛选出长度为1 079 bp稳定的保守区域，作为引物设计的目标片段，并利用目标片段序列作为引物探针，针对保守区使用Lamp Designer软件设计引物SM-1，其包括1对内引物（FIP，BIP）和1对外引物（F3，B3）。

1.3.3 等温扩增荧光法的建立

向扩增反应管中加入2.5 μL沙门氏菌DNA，18.5 μL反应液，4 μL引物，阴性对照加2.5 μL ddH2O，混匀。用GENIE Ⅱ设置扩增程序65 ℃反应40 min，熔解程序98～80 ℃，0.05 ℃为1个循环，根据扩增曲线和熔解曲线判定实验结果。

（1）特异性检测试验。用等温扩增荧光法对沙门氏菌和其他非沙门氏菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌和恶臭假单胞菌）菌株提取的DNA分别进行扩增。

（2）灵敏度检测实验。将沙门氏菌核酸样本（初始浓度为528 ng·μL-1）10倍比依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10浓度检测最低检测限。取八连管，每管分装18.5 μL Mix，

4 μL引物组，2.5 μL样本，用ddH2O作阴性对照。65 ℃反应40 min；熔解程序为98～80 ℃进行上机扩增。

1.3.4 常规PCR检测沙门氏菌

（1）重复性实验。向扩增反应管中加入1 μL沙门氏菌DNA（未稀释），12.5 μL反应液，2 μL引物（上游引物、下游引物各1 μL），9.5 μL ddH2O，混匀，设置一个空白对照，以ddH2O代替，重复7次，设置程序开始运行。完成电泳后，将凝胶块放置凝胶成像仪中，观察电泳条带。

（2）灵敏度检测实验。将沙门氏菌核酸样本（初始浓度为528 ng·μL-1）10倍比依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6浓度检测最低检测限。设置一个原液浓度、一个空白对照，分别对扩增后不同浓度的沙门样本进行电泳分析，根据其条带的亮度和清晰度分析其最低检测限。

2 结果与分析

2.1 引物設计

引物设计完成后，使用BLAST软件比对，结果发现，引物序列与沙门氏菌基因高度重合，且未匹配到其他病原的序列信息，初步证明SM-1引物有比较高的特异性。

2.2 等温扩增荧光法

2.2.1 特异性检测试验

对沙门氏菌和其他4种非沙门氏菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌和恶臭假单胞菌）同时进行检测，其结果只有沙门氏菌出现了特异性扩增，起峰时间在30 min以内，将时间延长至1 h后其他样本也未出现扩增，说明该试剂盒只针对沙门氏菌进行特异性检测。

2.2.2 灵敏性检测实验

由表1可知，当样本检测浓度大于等于10-4时，本试验所建立的等温扩增荧光检测方法均能在30 min内检出；当检测浓度低于10-4时未出现完整的扩增曲线，说明建立的等温扩增荧光技术能快速检测沙门氏菌的浓度为10-4，检测限为5.28×10-2 ng·μL-1。

2.3 常规PCR检测沙门氏菌的结果

2.3.1 PCR方法检测沙门氏菌的重复性

对沙门氏菌的DNA（未稀释）进行PCR扩增，重复10次，均可见清晰明显的288 bp大小的条带，与预期结果吻合，说明该引物重复性好。

2.3.2 PCR方法检测沙门氏菌的灵敏度

菌液稀释到10-3时候扩增效果不稳定，有微弱的条带但时常不会显现，因此判断10-2为常规PCR的最稳定的最低检测浓度，检测限为5.28 ng·μL-1，详见图1。与等温扩增荧光法相比，检测的灵敏度弱于等温扩增荧光法。

3 结论与讨论

传统的沙门氏菌检测方法整个过程需4～5 d，且过程烦琐[10]。聚合酶链式反应在沙门氏菌诊断方法中具有较高的特异性和灵敏度，是沙门氏菌感染诊断中最具有应用前景的一种方法。然而，常规PCR检测时间长，对反应环境要求较高，且检测仪器笨重。因此，建立一种反应快速、操作简单、特异性灵敏的方法至关重要。目前，等温扩增荧光法是一种能在恒定温度下进行体外核酸扩增的技术，已被广泛应用于医学病原物检测、食品安全检测和植物病原物的检测等方面[11]，有着极为广泛的应用前景。

本文测试了4种非沙门氏菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏杆菌和恶臭假单胞菌），结果发现，本方法只对沙门氏菌的检测结果呈阳性，而对4种非沙门氏菌的检测结果呈阴性，表明该方法特异性良好。同时梯度稀释方法进行沙门氏菌的灵敏度试验，并与常规PCR检测方法进行了比较。结果表明，本试验建立的等温扩增荧光法检测沙门氏菌的灵敏度为5.28×10-2 ng·μL-1，而常规PCR的检测限为5.28 ng·μL-1，比常规PCR灵敏100倍。

等温扩增荧光法不需要反复变换温度，检测速度、易携性等方面比PCR有很大的优势，有着操作简单、快速、敏感性和特异性好等特点，具有良好的发展前景，是病原检测的一项重要技术。

参考文献

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