超声辅助酶解法制备兔肉抗氧化肽工艺

雷雨婷 杨浩 孟凡冰 李云成 刘达玉 陈卫军 王梅

摘 要：以搅碎的兔肉末为原料，以超声辅助酶解制备抗氧化肽，对其抗氧化活性进行评价，发现抗氧化活性较好.比较不同酶制备的抗氧化肽的DPPH自由基清除率，从胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶中筛选出最佳用酶，利用单因素实验和响应面法优化了兔肉酶解的工艺条件.结果表明，酶解效果最好的是胰蛋白酶，在超声时间22.5 min，超声温度37℃，超声功率330 W的條件下酶解得到的抗氧化肽DPPH自由基清除率最好，为81.17%，与响应面优化实验回归模型的预测值基本一致；在此基础上制备兔肉抗氧化肽，对酶解液的ABTS、羟基自由基和超氧阴离子清除率进行检测，值分别为44.03%、94.69%和34.32%，均大于未酶解液.该研究可以为制备兔肉抗氧化肽方面提供理论依据和数据支持.

关键词：兔肉；抗氧化肽；响应面法；超声酶解法；制备工艺

中图分类号：TS251.54

文献标志码：A

0 引 言

兔肉含有较高的多不饱和脂肪酸、蛋白质和维生素等营养成分，同时其能量值适中、脂肪低和胆固醇低等优点有助于人体健康［1］.兔肉蛋白高于猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉，其蛋白质含量高达21%左右.生物活性肽主要指具有特定生物学功能的多肽，相对分子质量小于 6 kDa［2］.肉类蛋白经酶解加工后，结构复杂的大分子蛋白质降解为肽，进一步提高了肉的营养价值和消化利用率等.生物活性肽表现出多种生物功能，其中，抗氧化活性至关重要，抗氧化肽可分为内源性或外源性肽2类［3］.内源性抗氧化肽天然存在于细胞中，外源性抗氧化肽来源于外部.研究证明，外源性抗氧化肽表现出自由基清除的能力，是一种理想的抗氧化剂［4］.抗氧化肽是一种特殊的蛋白质片段，含有营养成分和其他对机体功能产生积极影响的成分，可以通过动植物蛋白酸解、酶解或微生物发酵获得［5］.这些方法中，酶解具有温和的水解条件，且快捷、可控、便于重复，然而，传统酶解法能耗大、费时、酶解效率偏低.因此，利用高压处理、超声辅助及微波辅助等酶解方式可大大提高酶解效率［6］.Gao等［7］研究证明，超声波对酱油作用后显著增加了其抗氧化活性.本研究利用超声辅助蛋白酶水解兔肉蛋白获得抗氧化肽，并以抗氧化活性为指标优化水解工艺，相关研究可为兔肉精深加工和高值化利用提供一定的参考.

1 材料与方法

1.1 仪 器

PHS-3E型pH计（上海雷磁公司），UV-1800PC型紫外可见分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司），LE104E-02型电子分析天平（梅特勒—托利多集团），KQ-3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），THZ-82型水浴恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司），SF-TGL-16M型台式高速离心机（上海赵迪生物科技有限公司），H1M型多功能微孔板检测仪（科瑞恩特（北京）科技有限公司）.

1.2 材 料

新鲜兔肉胴体（伊拉兔），购自成都市龙泉驿区十陵镇农贸市场；胰蛋白酶（2 500 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（≥14 000 U/mg）、菠萝蛋白酶（≥600 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、维生素C、邻苯三酚、水杨酸，均购自上海源叶生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），购自上海华蓝化学科技有限公司；硫酸亚铁（FeSO4），购自天津市大茂化学试剂厂；过硫酸钾（K2S2O8），购自天津市致远化学试剂有限公司；20X PBS缓冲液，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；过氧化氢（H2O2）、无水乙醇、盐酸、氢氧化钠，均购自成都市科隆化学品有限公司.

1.3 方 法

1.3.1 兔肉蛋白酶解工艺研究

1）酶的选择.取新鲜兔肉（腰部）1 g，搅碎，按照表1所示料液比分别加入兔肉末，在温度40 ℃，功率330 W条件下超声15 min，调节pH值后在不同温度下保温30 min，以酶的活性（10 000 U/g）为基准添加不同酶量，不同温度下水解2 h后，4 000×g，20 ℃离心10 min，经滤纸过滤得上清液，检测上清液的DPPH清除率.

2）单因素实验.超声时间、温度和功率大小会显著影响生物活性肽抗氧化能力，所以选择超声时间、温度和功率大小进行单因素实验.筛选出最适酶后，根据酶的性质和预实验结果，在超声时间20 min，超声温度40℃，超声功率330 W，水解时间为2 h，料液比（底物∶水）为1∶40，酶添加量为3‰的基础上，以DPPH清除率为指标，进行单因素实验.

超声时间：固定超声温度为40 ℃，超声功率330 W，酶解pH值为8的条件下，以超声时间分别为0、10、20、30和40 min进行酶解，研究超声时间对DPPH清除率的影响.

超声温度：固定超声时间为20 min，超声功率330 W，酶解pH值为8的条件下，以超声温度分别为20、30、40、50和60 ℃进行酶解，研究超声温度对DPPH清除率的影响.

超声功率：固定超声时间为20 min，超声温度为40 ℃，酶解pH值为8的条件下，以超声功率分别为220、330、385、440和550 W进行酶解，研究超声功率对DPPH清除率的影响.

3）响应面实验.结合单因素实验的结果，以蛋白水解物DPPH清除率为评价指标，选择超声时间、超声温度和超声功率3个因素设计响应面实验，采用中心组合 Box-Behnken Design 优化设计方案，建立回归模型，得到最佳工艺.

1.3.2 DPPH法测定抗氧化肽抗氧化活性

DPPH自由基是少数稳定的自由基来源之一，广泛用于测定抗氧化剂给电子和自由基清除能力，进而用于定量测定生物试样、纯化合物和提取物的体外抗氧化能力，评估天然化合物自由基清除活性［8］.参考文献［7］的方法稍作修改.将酶解后的样液与0.10 mmol/L的DPPH按照1∶1混合，黑暗中反应30 min后，于517 nm波长处测定吸光度（A1），分别以无水乙醇代替DPPH和无水乙醇代替样液作为对照组（A2）和空白组（A0）.清除率计算公式为，

DPPH清除率=［1-（A1－A2）/A0］×100%（1）

1.3.3 ABTS法测定抗氧化肽抗氧化活性

ABTS用于评价抗氧化剂清除自由基的能力，该方法既可用于测定水溶性化合物的抗氧化能力，也可用于测定脂溶性化合物的抗氧化能力.K2S208与ABTS直接生成稳定的阳离子自由基 ABTS+，抗氧化物质与ABTS+发生反应而使反应体系褪色.参考文献［9］的方法稍作修改.将5 mL ABTS溶液（7 mmol/L）和5 mL K2S2O8溶液（2.45 mmol/L）混合之后，于室温暗反应12 h后制成ABTS+储备液.测定时用PBS缓冲液稀释，使其在734 nm波长处的吸光度为0.7±0.02，pH值为7.40.取酶解液30.00 μL与ABTS工作液170.00 μL混合，黑暗中反应10 min，于734 nm波长处测定吸光度（A1），分别以PBS 代替ABTS作为对照组（A2）和PBS代替样液作为空白组（A0）.清除率计算公为，

ABTS清除率=［1-（A1－A2）/A0］×100%（2）

1.3.4 羟基自由基法测定抗氧化肽抗氧化活性

羟基自由基是活性氧中活性最强的自由基，引发自由基链式反应攻击所有生物分子［10］.参考文献［10］的方法略作修改.配制8 mmol/L的FeSO4溶液，20 mmol/L的H2O2溶液，以及3 mmol/L水杨酸溶液.取0.34 mL样品与0.1 mL FeSO4溶液、0.34 mL水杨酸溶液及0.08 mL H2O2溶液混匀，37 ℃保温30 min后流水冷却.加入0.15 mL蒸馏水使反应液总体积达1 mL，离心10 min后于510 nm波长处测定上清液吸光值（A1），分别以蒸馏水代替样品和H2O2溶液作为对照组（A2）和空白组（A0）.清除率计算公式为，

羟基自由基清除率=［1-（A1－A2）/A0］×100%（3）

1.3.5 超氧阴离子法测定抗氧化肽抗氧化活性

超氧阴离子是一种弱氧化剂，会产生强大而危险的羟基自由基及单线态氧，这两者都会导致氧化应激.参照文献［11］的方法略作修改.取0.05 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（pH值为8.20） 5 mL，置于25 ℃水浴中预热20 min，分别加入0.50 mL样品溶液和0.50 mL邻苯三酚溶液（25 mmol/L），混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，加入1 mL 盐酸溶液（8 mol/L）终止反应，299 nm波长处测定吸光度（A1），分别以蒸馏水代替样品和邻苯三酚溶液作为对照组（A2）和空白组（A0）.清除率计算公式为，

超氧阴离子清除率=［1-（A1－A2）/A0］×100%（4）

2 结果与分析

2.1 酶的选择

蛋白酶解是指蛋白质在各种蛋白酶作用下降解成氨基酸的过程.蛋白酶具有专一性，可用于食品和制药行业生产生物活性肽.最常用的酶来自动物组织（胃蛋白酶和胰蛋白酶）、植物（木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶）和微生物.据报道，木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解产物已经显示出显著的抗氧化能力，其中，胰蛋白酶是应用较广泛的动物蛋白酶［12］.另外，菠萝蛋白酶和中性蛋白酶广泛用于制备抗氧化肽.综上，选择胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶5种酶进行筛选.以DPPH清除率为指标，在酶活性、超声时间和酶解时间均相同的条件下，得到胰蛋白酶的DPPH清除率最好，为86.60%，其次依次是木瓜蛋白酶（78.40%）、菠萝蛋白酶（76.50%）、中性蛋白酶（69.60%）和碱性蛋白酶（62.10%）（见图1）.并且王令充等［13］在研究酶解制备四角蛤蜊抗氧化活性肽中同样是胰蛋白酶水解液的DPPH清除率最高，因此使用胰蛋白酶进行后续研究.

2.2 单因素实验结果

超声波是一种机械波，可以增强酶促反应，克服酶解效率低的缺点.高超声功率会引起更大的剪切力，然而，在食品行业中，通常会优化此参数，以使用最小功率达到最佳效果.

2.2.1 超声时间对蛋白水解产物抗氧化活性的影响

控制其他条件一致，用超声处理不同时间.超声处理后抗氧化肽的DPPH清除率大于未进行超声处理的DPPH清除率，且在超声一定时间时，DPPH清除率有所提高，在20 min内，DPPH清除率达到最大值（见图2）.随着超声时间的加长，整个酶解反应体系会更加均匀化，底物蛋白的空间构象发生积极变化，蛋白质内部的酶切位点暴露，促进底物与酶结合，酶解具有抗氧化能力的小分析肽，使DPPH清除率增大.但时间过长后，DPPH清除率降低主要是因为超声的热效应与剪切力影响酶活性的同时，小分子多肽灵活性高，导致具有抗氧化能力的多肽结构遭到破坏［14］，另外，可能是由于活性多肽被进一步酶解成无活性的小肽，因此，DPPH清除率降低.由此可以说明，适当的超声时间对酶解抗氧化肽有积极影响.

2.2.2 超声温度对蛋白水解产物抗氧化活性的影响

控制其他条件一致，用不同超声温度处理样品，在30 ℃时DPPH清除率最高，20 ℃和60 ℃时对酶活性影响较大，清除率都较低（见图3）.超声过程中，可能由于超声的空化作用对酶活性中心产生破坏，使活性肽得率降低，导致清除率下降［15］.有研究证明，温度对酶活性的影响大于空化效应，温度过高时，酶發生热变性，酶解效率低，从而清除率大大降低［16］.因此，温度对酶活性的影响很大，尤其是高温对酶的影响是不可恢复的.

2.2.3 超声功率对蛋白水解产物抗氧化活性的影响

控制其他条件一致，用不同的超声功率处理样品，在功率为330 W时DPPH清除率最高（见图4）.超声功率会影响蛋白酶的酶活性与结构变化，超声功率增大，导致空化效应更加剧烈，使其破碎细胞壁的能力增大，促进了接触面积，酶解效率就增大，抗氧化肽增多，DPPH清除率增大［15］.但是当强度过大时，反而出现抑制作用，可能是因为功率太大，导致酶活性降低和抗氧化肽失活，或者超声的热效应导致抗氧化肽降解［17］.因此，一定强度的超声功率对抗氧化肽的DPPH清除率有促进作用.

2.3 响应面实验设计及结果分析

在单因素的基础上，选择超声时间10、20和30 min，超声温度30、35和40 ℃，超声功率275、330和385 W，运用中心组合Box-Behnken Design优化设计方案，响应面实验方案和结果见表2，回归方程方差分析见表3，响应面和等高线图如图5～图7所示.

由表3和图5～图7可知，因素水平范围内，超声时间、超声温度和超声功率对酶解后的水解多肽的DPPH清除率均有显著影响（p<0.01）；其中，超声时间和超声温度有较显著的交互作用（p<0.05），超声温度和超声功率之间的交互作用较小，超声时间和超声功率的交互作用最小.

最佳工艺条件为超声时间22.47 min，超声温度36.81 ℃，超声功率为337.10 W.结合实际应用，超声时间22.50 min，超声温度37 ℃，超声功率330 W.模型预测在此条件下DPPH清除率最大理论值为81.30%，在最佳工艺条件下，重复实验3次进行验证，实际DPPH清除率为81.17%，接近理论值，说明该模型可用.

2.4 ABTS、羟基自由基与超氧阴离子检测清除率

根据单因素和响应面的结果，在最优条件下得到的水解多肽，以维生素C（Vc）作为对照，进一步通过ABTS法、羟基自由基法与超氧阴离子法测定其抗氧化活性.

2.4.1 ABTS清除率

ABTS被活性氧氧化以后能够生成稳定的蓝绿色ABTS+，然后向其中加入被测物质，如果该物质含有抗氧化成分，反应体系就会发生褪色.在最优条件下酶解液的ABTS清除率为44.03%，未酶解液的ABTS清除率为7.64%，证明酶解液的抗氧化活性大于未酶解液，结果详见表4.

2.4.2 羟基自由基清除率

将样品加入反应体系清除羟基自由基，从而降低吸光度，测定样品对羟基自由基的清除能力.在最优条件下酶解液的羟基自由基清除率为94.69%，未酶解液的羟基自由基清除率为68.92%，酶解液和Vc抗氧化活性能力相当，说明酶解液的羟基自由基清除率较好，结果详见表5.

2.4.3 超氧阴离子清除率

在最优条件下酶解液的超氧阴离子清除率为34.32%，未酶解液的超氧阴离子清除率为31.57%.酶解前后清除率较Vc小，但是酶解液相对未酶解液超氧阴离子清除率高，结果详见表6.

3 结 论

利用响应面法建立抗氧化肽工艺的模型，通过方差分析，所得模型较显著，回归方程拟合度较好.抗氧化肽最佳制备工艺为超声时间22.50 min，超声温度37 ℃，超声功率为330 W.此工艺条件下制备的兔肉抗氧化肽DPPH自由基清除率为81.17%，与理论值81.30%无显著差异，表明通过响应面分析得到的回归方程能较好地预测实验结果.此外，该工艺下制得的抗氧化肽具有较好的抗氧化能力值，ABTS清除率为44.03%，羟基自由基清除率为94.69%，超氧阴离子清除率为34.32%.数据表明，兔肉抗氧化肽具有良好的抗氧化能力，兔肉蛋白质在制备水解物方面具有一定的潜在價值.

参考文献：

［1］Wang Z M，He Z F，Gan X，et al.Interrelationship among ferrous myoglobin，lipid and protein oxidations in rabbit meat during refrigerated and superchilled storage［J］.Meat Sci，2018，146：131-139.

［2］潘芬.豌豆抗肿瘤活性肽的分离纯化及结构鉴定［D］.天津：天津科技大学，2019.

［3］Torres-Fuentes C，Alaiz M，Vioque J.Iron-chelating activity of chickpea protein hydrolysate peptides［J］.Food Chem，2012，134（3）：1585-1588.

［4］Li T T，Shi C Y，Zhou C Y，et al.Purification and characterization of novel antioxidant peptides from duck breast protein hydrolysates［J］.LWT-Food Sci Technol，2020，125：109215-1-109215-7.

［5］黄明，王璐莎.动物蛋白源抗氧化肽的研究进展［J］.中国农业科学，2013，46（22）：4763-4773.

［6］Kadam S U，Tiwari B K，Alvarez C，et al.Ultrasound applications for the extraction，identification and delivery of food proteins and bioactive peptides［J］.Trends Food Sci Tech，2015，46（1）：60-67.

［7］Gao X，Liu E，Zhang J，et al.Effects of sonication during moromi fermentation on antioxidant activities of compounds in raw soy sauce［J］.LWT-Food Sci Technol，2019，116：108605-1-108605-8.

［8］Shuang L X，Li A，Ni H，et al.Antioxidant and immunoregulatory activity of different polysaccharide fractions from tuber of Ophiopogon japonicus［J］.Carbohyd Polym，2011，86（3）：1273-1280.

［9］Samavati V，Manoochehrizade A.Polysaccharide extraction from Malva sylvestris and its anti-oxidant activity［J］.Int J Biol Macromol，2013，60：427-436.

［10］孙雪萍，徐艳，刘布鸣，等.沙虫蛋白酶解产物抗氧化与免疫调节活性的研究［J］.现代食品科技，2017，33（4）：67-72.

［11］Sánchez-Moreno C，Larrauri J A，Saura-Calixto F.Free radical scavenging capacity and inhibition of lipid oxidation of wines，grape juices and related polyphenolic constituents［J］.Food Res Int，1999，32（6）：407-412.

［12］Pedrouso M L，Borrajo P，Pateiro M，et al.Antioxidant activity and peptidomic analysis of porcine liver hydrolysates using alcalase，bromelain，flavourzyme and papain enzymes［J］.Food Res Int，2020，137：109389-1-109389-8.

［13］王令充，劉睿，郑文文，等.酶解制备四角蛤蜊抗氧化活性肽的工艺研究［J］.食品工业科技，2011，32（10）：285-287.

［14］罗晓慧.珠蚌抗氧化肽的加工工艺研究［D］.南昌：南昌大学，2012.

［15］陶然，何东平，胡传荣，等.超声波辅助提取芝麻蛋白的工艺研究［J］.中国油脂，2014，39（5）：23-26.

［16］Resa P，Elvira L，Sierra C，et al.Ultrasonic velocity assay of extracellular invertase in living yeasts［J］.Anal Biochem，2009，384（1）：68-73.

［17］田雨.羊肚菌蛋白质提取及抗氧化肽制备研究［D］.太原：山西大学，2020.

（责任编辑：伍利华）

Abstract：

By using minced rabbit meat as raw material，antioxidant peptides were prepared by ultrasound-assisted enzymatic hydrolyzation.The antioxidant activity was evaluated and it was found that the antioxidant activity was better.The DPPH radical scavenging rates of antioxidant peptides prepared by different enzymes were compared，and the best enzymes were selected from trypsin，alkaline protease，neutral protease，bromelain and papain.The enzymatic hydrolysis conditions of rabbit meat were optimized by single factor experiment and response surface method.The results show that the best effect of enzymatic hydrolysis is trypsin，and the scavenging rate of antioxidant peptide DPPH free radical obtained by enzymatic hydrolysis is the best at 81.17%under the condition of ultrasonic time 22.5 min，ultrasonic temperature 37 ℃ and ultrasonic power 330 W，which is basically consistent with the predicted value of the regression model of response surface optimization test.On this basis，rabbit meat antioxidant peptides are prepared，and the ABTS radical scavenging rate，hydroxyl radical scavenging rate and superoxide anion scavenging rate of the enzymatic hydrolysate are 44.03%，94.69% and 34.32%，respectively，which are higher than those of the non-enzymatic hydrolysate.This study can provide theoretical basis and data support for the preparation of rabbit meat antioxidant peptides.

Key words：

rabbit meat;antioxidant peptides;response surface methodology;ultrasonic enzymolysis;preparation technology