菊花组培快繁体系的初步建立

王健蓉 吴嘉纯 王春丹 林天友 苏镇祥 陈桂玲 曾宝珰

(汕头市农业科学研究所，广东 汕头 515000)

菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是菊科菊属多年生宿根草本植物，是中国传统名花之一，在中国已有3000多年的栽培历史。菊花花色丰富，花形优美，品种多样，现已成为世界普遍栽培的花卉，不仅具有观赏价值，还有药用和茶用价值。汕头市濠江区东湖社区有栽培菊花的传统。20世纪80年代，村民将菊花从外地引进东湖，采摘的鲜菊花通过传统手工的蒸烘方式制成干品，用于泡酒和泡茶，赠送亲朋好友。后来便发展成家家户户都有种植。传统使用扦插的方法进行菊花繁殖，如蔡晓霖[1]采用扦插的方式繁育茶用“福白菊”种苗。为深入探索东湖小黄茶菊(下称“东湖”菊花)种苗规模化生产及复壮提纯的有效过程，本试验采用组培的方法对“东湖”菊花生长条件或再生体系进行研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择“东湖”菊花中生长发育良好、没有病害感染、健壮的优良单株，采集新鲜、未木质化的茎段作为诱导材料。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

选用健康单株，取其茎段作为诱导材料，去除叶片，留有带腋芽茎段，用流水冲洗干净，然后在超净工作台用75%酒精浸泡30s，再用0.1%升汞溶液消毒10min，用无菌水冲洗4～5次，沥干水分。

1.2.2 诱导培养

消毒好的茎段切成带有2～3个腋芽，接种于诱导培养基MS加6-BA 0.2mg·L-1加糖30g·L-1加琼脂粉5g·L-1，pH值为5.8中培养。每瓶培养基接种单个茎段，置于温度为24℃±2℃，光照强度1000lx，光照时间12h培养室中培养，30d后统计污染率和萌发率。计算公式：

污染率(%)=污染瓶数/接种总瓶数×100

萌发率(%)=长芽株数/接种总株数×100

1.2.3 增殖培养

菊花茎段诱导培养30d后，腋芽已经萌发成丛生芽。设置含有不同质量浓度6-BA的MS培养基进行增殖培养。培养基分别为MS加6-BA 0.2mg·L-1加糖30g·L-1加琼脂粉5g·L-1(A1)、MS加6-BA 0.5mg·L-1加糖30g·L-1加琼脂粉5g·L-1(A2)、MS加6-BA 1.0mg·L-1加糖30g·L-1加琼脂粉5g·L-1(A3)、MS加6-BA 2.0mg·L-1加糖30g·L-1加琼脂粉5g·L-1(A4)、MS加糖30g·L-1加琼脂粉5g·L-1(A5)，pH值为5.8。其中，以A1～A4为处理组，A5为对照组。置于温度为24±2℃，光照强度1000lx，光照时间12h培养室中培养。30d后统计污染率、萌发率和出芽指数。计算公式：

出芽指数=总芽数/接种总株数

1.2.4 生根培养

将增殖培养30d的丛生芽切分成单芽，每个单芽达3～4cm时即可进行生根培养。采用不同促进根部生长的激素进行生根效果比较，培养基分别为1/2MS加IBA 0.1mg·L-1加活性炭0.1g·L-1加糖30g·L-1加琼脂粉5g·L-1(B1)、1/2MS加NAA 0.1mg·L-1加活性炭0.1g·L-1加糖30g·L-1加琼脂粉5g·L-1(B2)、1/2MS加IBA 0.1mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1加活性炭0.1g·L-1加糖30g·L-1加琼脂粉5g·L-1(B3)，pH值为5.8，温度为24±2℃，光照强度4000～6000lx，光照时间12h。30d后统计污染率、生根率、单株平均根数和单株平均根长。计算公式：

生根率(%)=生根株数/接种总株数×100

单株平均根数=总根数/生根株数

单株平均根长=总根长/生根株数

1.2.5 出瓶移栽

经过30d的生根培养后，菊花组培苗可以脱瓶栽植。取出组培苗，洗净根部培养基，移栽到泥炭土∶河沙=1∶1的基质中，喷药消毒，30d后统计成活率。计算公式：

成活率(%)=成活株数/移栽总株数×100

试验数据采用Excel 2010整理，应用SPSS 22.0软件的One-Way NOVOA模块进行方差分析和LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 “东湖”菊花的诱导培养

“东湖”菊花初代诱导培养，污染率为0%，萌发率为100%。带腋芽的菊花茎段接入诱导培养基后，约14d后腋芽萌动，30d后新芽可生长约6～8cm。

2.2 “东湖”菊花的增殖培养

由表1可知，“东湖”菊花增殖培养30d后，含有不同质量浓度6-BA的MS培养基均对菊花腋芽萌发起诱导效果，而对出芽数量则有所差别，如图1所示。5种增殖培养基中菊花茎段的萌发率均达到100%，且腋芽均能萌发成丛生芽。A1和A2培养基中丛生芽的长势好，A3培养基中丛生芽长势一般，新芽较矮。A4培养基丛生芽矮小，部分新芽玻璃化，生长异常。A1和A5的出芽指数无显著差异，但A1添加6-BA能促进丛生芽快速伸长。A3的出芽指数最高，达到4.42，丛生芽数量多，叶色青，但是长势一般，新芽矮小。

表1 “东湖”菊花的增殖培养调查结果

注：图片编号a～e分别对应增殖培养基A1～A5。

2.3 “东湖”菊花的生根培养

截取3～4cm的菊花茎段进行生根培养，约14d后开始长根，培养30d后，根系长满培养基底部。由表2可知，3种培养基的污染率均为0%，生根率均达到98%。3种培养基的单株平均根数和平均根长均无显著差异，单株平均根数为5条以上，单株平均根长达到9cm以上。

表2 “东湖”菊花的生根培养调查结果

2.4 “东湖”菊花组培苗移栽

将菊花组培苗洗净根部培养基，根部用1000倍多菌灵溶液浸泡后，移栽到泥炭土∶河沙=1∶1的基质中，浇足定根水后，置于光照强度为15000lx的苗棚中，约7d时间，后移至自然光环境中，每天喷水2次，见图2。30d后成活率达到100%，叶片绿，苗壮，长势好。

图2 “东湖”菊花组培苗移植成活情况

3 结论与讨论

本研究以“东湖”菊花的带芽茎段为外植体探索组织培养条件，试验结果表明，增殖阶段以MS为基本培养基，不添加6-BA并不影响菊花腋芽萌发，而添加不同质量浓度的6-BA则能促使腋芽萌发的同时使叶芽快速增殖，形成大量丛生芽。相比基本培养基，添加0.2mg·L-1的6-BA能使菊花茎段快速伸长；添加1.0mg·L-1的6-BA虽能大量增殖叶芽，但菊花茎段生长受抑制；而添加0.5mg·L-1的6-BA既能大量增殖叶芽，又能使菊花茎段伸长。因此，选择MS加6-BA 0.5mg·L-1加糖30g·L-1加琼脂粉5g·L-1作为“东湖”菊花增殖阶段的最适培养基。同样以菊花茎段为试材的已有报道[2-8]，增殖培养基中6-BA添加浓度为1.0～3.0mg·L-1，本研究选择的增殖培养基中6-BA仅0.5mg·L-1，浓度低，这是基于菊花的新芽增殖和茎段伸长效果进行挑选的，也与菊花的品种特性有关。

生根阶段以1/2MS为基本培养基，添加0.1mg·L-1的IBA或NAA均能有效诱导生根，单株根数达到5～6根，平均根长达到9cm以上，根多且长，有利于后期组培苗移栽驯化。

“东湖”菊花作为草本植物，具有观赏、药用、茶用等价值，既可美化人居环境，提升农村风貌，又有极高的药用价值，医药行业对药用菊花的需求也日益增长。目前，“东湖”菊花仍属于小范围、小规模生产，并未实现规模化、产业化生产，如何有效利用东湖本地的菊花种质资源产出更多高品质的菊花，成为“东湖”菊花发展的首要问题。随着菊花组织培养[9，10]的技术日益成熟，借助这一技术可快速提高菊花种苗产量，保证菊花种苗质量。此外，随着菊花栽培面积不断扩大，病害状况日趋加重，菊花病害日渐成为菊花产业健康发展的限制因素。病毒病是严重影响菊花健康生产的因素之一，菊花感染病毒后，病毒的累积导致菊花品种退化，长势变差，产量和质量不理想[11]。因此，今后有必要开展菊花脱毒苗的组培技术研究，包括菊花的脱毒手段、病毒检测以及各个阶段的组织培养等多方面的技术仍需要探索。