miR-122a诱导喉癌细胞多西他赛增敏的信号机制研究

孙俏洁 李祥平 杨群菲

喉癌（laryngeal cancer）为常见的头颈部恶性肿瘤，据报道，喉癌的五年总体生存率为32%～70%，且男性患者多于女性［1］。喉癌患者确诊后常需要接受手术、放射治疗和化学治疗。多西他赛（Docetaxel，DOC）为喉癌治疗的一线化疗药物，可通过影响微管的聚合而发挥细胞毒作用，但仍有部分患者对DOC 不敏感［2］。因此，如何增强喉癌细胞对DOC 的敏感性是临床治疗亟待解决的问题。miR-122a 属于转录本长度在22～25 nt 范围内的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）。研究发现外源性过表达miR-122a 能显著抑制喉癌细胞Hep2 的增殖能力［3］，但其抑制Hep2 细胞增殖的信号机制不完全清楚，其是否影响喉癌细胞对DOC 的敏感性暂无报道。为此，本研究以Hep-2 细胞为观察对象，通过外源性过表达miR-122a，观察细胞对DOC 的敏感性变化，同时对其作用机制进行研究，为临床治疗喉癌提供基础理论支持。

1 材料与方法

1.1 细胞 人喉癌细胞Hep-2（ATCC CCL-23）购自北纳生物公司。

1.2 主要试剂 DOC 购自浙江海正药业公司，miR-122a 慢病毒转染试剂盒购自山东维真生物公司，RPMI1640 培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco 公司，TRIZOL、逆转录试剂盒、RTFQ-PCR 试剂盒购自大连TaKaRa 公司，BCA 蛋白定量试剂盒、RIPA 蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂购自上海碧云天公司，ECL 化学发光试剂盒购自美国Millipore 公司，表皮生长因子受体（EGER）抗体（4267S）、p-EGFR（3777S）、蛋白激酶B（AKT）抗体（4685S）、p-AKT 抗体（4060S）、抗兔IgG-HRP 抗体（7074S）、抗兔 IgG（H+L），F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor® 594 Conjugate）（8889S）、抗兔IgG（H+L），（Alexa Fluor® 488 Conjugate）（4416S）购自美国CST 公司。

1.3 实验仪器 CKX41 倒置显微镜（日本Olympus 公司产品）；HERAguard ECO1.5 超净工作台（美国Thermo Scientific 公司产品）；Allegra 64R Centrifuge 台式高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter 公司产品）；ABI Prism®7300型荧光定量PCR仪（美国ABI公司产品）；Model550酶标仪、电泳仪、转膜槽及转印夹（美国Bio-Rad 公司产品）；GE600 凝胶成像仪（美国GE 公司产品）。

1.4 实验方法（1）细胞培养、慢病毒转染及分组：人喉癌细胞Hep2 培养在含10% FBS 的RPMI1640培养基中，培养环境为37℃，5% CO2，95%相对湿度的培养箱。慢病毒转染法构建miR-122a 过表达细胞：将载有miR-122a 的慢病毒和空载慢病毒稀释5倍，分别加入Hep-2 细胞中培养细胞24 h，传代两次后以1 μg/mL 嘌呤霉素对细胞进行筛选。将过表达miR-122a 的Hep-2 细胞设为过表达组，转染空白载体的细胞设为空载对照组，以未转染细胞作为空白对照组。（2）RTFQ-PCR 检测细胞miR-122a 表达水平：培养空白对照组、空载对照组和过表达组细胞至对数期，收集细胞，TRIZOL 法提取细胞总RNA，将RNA 以逆转录试剂盒逆转录为cDNA。将miR-122a 正向引物和反向引物稀释后按1 ∶1 混合，以RTFQ-PCR 试剂盒在ABI 7300 型实时荧光定量PCR 仪中进行扩增检测，每组设置3 个重复孔。以U6 作为内参，2-△△CT法计算miR-122a 的相对表达水平。miR-122a 引物序列如下，正向引物：5’-CAAGCGTTGGAGTGTGACA-3’，反向引物：5’-CGTCCTACCATTCTCCAGC-3’；内参U6 引物如下，正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。（3）四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞活力：培养空白对照组、空载对照组和过表达组细胞至对数期，各组细胞按1×104个/孔接种于96 孔板中，每组细胞设7 个浓度梯度，每个浓度5 个重复孔。次日，将细胞更换为含0、0.5、1、5、10、20、50 mg/L DOC 的RPMI1640 培养基，同时设置调零孔和对照孔，放入培养箱继续培养24 h。24 h 时，每孔加入20 μL MTT，放入培养箱继续培养4 h。弃去细胞培养液，每孔加入100 μL 二甲基亚砜。在酶联免疫检测仪A490 nm 处测量各孔的吸光值。制作细胞生长曲线，并计算各组细胞的细胞半数抑制浓度（IC50）。（4）结晶紫染色观察细胞贴壁存活情况：培养空白对照组、空载对照组和过表达组细胞至对数期，各组细胞按5×105个/孔接种于6 孔板中，当汇合度达到60%～70%时，细胞同步化12 h。而后聚山梨酯-80（溶剂，1‰）和DOC（5.56 μg/mL）分别处理各组细胞24 h。处理结束后细胞PBS 洗3 遍，每孔加入1 mL 固定液（4%多聚甲醛）固定10 min，PBS 洗1 遍，各加入1 mL 结晶紫染色液染色10 min，双蒸水洗两遍，倒置显微镜下拍照。每组随机视野拍照3～5 张，人工计数后计算细胞贴壁存活率。（5）蛋白质印迹（Western blot）法检测细胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表达：培养各组细胞至对数期，按1×106个/皿接种于6 cm 培养皿中，适时收集细胞，用RIPA 细胞裂解液提取总蛋白，12,000 r/min 离心20 min（r=8 cm），将上清液以BCA 蛋白定量试剂盒进行定量，制备含35 μg/15 μL 的蛋白样品，100 ℃变性，采用SDS-PAGE 电泳分离蛋白，将蛋白从凝胶转印至PVDF 膜上，5 %脱脂牛奶封闭过夜，次日孵育EGFR（1 ∶2,000）、p-EGFR（1 ∶1,000）、AKT（1 ∶3,000）、p-AKT（1 ∶1,000）或内参抗体GAPDH（1 ∶5,000）3 h，TBST 洗膜3 次，孵育羊抗兔IgG-HRP 抗体1 h，TBST 洗膜3 次，以ECL 化学发光液进行显色，GE600 凝胶成像仪下成像并读取相应蛋白条带。（6）免疫荧光法检测细胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表达：培养空白对照组、空载对照组和过表达组细胞至对数期，各组细胞按5×105个/孔接种于放置盖玻片的6 孔板中，培养过夜，弃去培养基，PBS 洗1 遍，细胞以4 %多聚甲醛固定10 min，PBS 洗2 遍，取出载玻片并以0.5% TritonX-100 通透10 min，PBS 洗2 遍，以8%山羊血清封闭1 h，而后滴加p-EGFR（1 ∶500）和p-AKT（1 ∶500）4 ℃孵育过夜，PBST 洗3 遍，避光孵育荧光二抗（1 ∶300）1 h，PBTS 浸洗3 遍，DAPI染色5min，洗去DAPI 后封片，于倒置荧光显微镜下拍照并记录荧光强度。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。计量资料以（）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两两多重比较方法采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞miR-122a 表达水平差异 RTFQ-PCR结果显示，空白对照组和空载对照组miR-122a 表达水平无明显差异；与空载对照组比较，过表达组细胞miR-122a 表达明显升高（F=264.9，P＜0.001），见图1。

图1 各组细胞miR-122a表达变化（注：与空载对照组比较，** P＜0.01。n=3）

2.2 DOC对各组细胞的IC50值的比较 MTT实验结果显示，DOC 对空白对照组、空载对照组及过表达组细胞的IC50 值分别为（15.26±2.13）μg/mL、（15.65±2.02）μg/mL 及（5.56±0.71）μg/mL。空白对照组与空载对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）；而与空载对照组比较，过表达组细胞IC50 明显降低（F=32.24，P＜0.001），见图2。

图2 DOC处理后各组细胞活力曲线（注：n=6）

2.3 DOC 处理后各组细胞贴壁存活率差异 溶剂聚山梨酯-80（1‰）处理对各组细胞无明显影响。以DOC（5.56 μg/mL）处理细胞24 h 后，空白对照组与空载对照组贴壁存活率无明显差异；与空载对照组比较，过表达组细胞贴壁存活率明显降低（F=123.5，P=0.001），见图3。

图3 DOC处理后各组细胞贴壁存活率（注：*P＜0.01，# P＜0.05，△P＜0.05。n=3）

2.4 各组细胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表达变化 Western blot 结果显示，空白对照组与空载对照组p-EGFR 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；而与空载对照组比较，过表达组细胞p-EGFR 蛋白表达明显降低（F=85.32，P＜0.001）。空白对照组与空载对照组p-AKT 表达差异无统计学意义（P＞0.05）；而与空载对照组比较，过表达组细胞p-AKT 蛋白表达明显降低（F=90.66，P＜0.001）。免疫荧光结果显示，与空载对照组比较，过表达组细胞p-EGFR 和p-AKT 荧光强度明显降低（F=44.73，P＜0.001；F=52.47，P＜0.001），空白对照组和空载对照组无明显差异。

3 讨论

miR-122a 在调节糖尿病代谢、肠上皮通透性以及生殖细胞行为等方面发挥着重要作用［4］。研究报道，miR-122a 常在肝细胞癌中表达下调，并具有抑制肝癌细胞生长的生物学功能［5］。另有研究发现miR-122a 可靶向细胞周期蛋白G1 并下调后者的蛋白表达水平，从而影响正常的癌细胞周期进程［6］。提示miR-122a 可能作为一种抑癌信号分子参与恶性肿瘤细胞发展。

喉癌作为难治性恶性肿瘤，目前化疗仍是其主要治疗手段之一。然而，部分喉癌患者常对某些化疗药物（如DOC）不敏感，这限制了一些化疗方案的应用。因此，如何解决喉癌对化疗药物的敏感性具有重要的临床意义。本研究通过转染法成功构建了miR-122a 过表达的喉癌Hep-2 细胞，并发现DOC 对细胞的IC50 显著下降，同时DOC 处理后细胞贴壁存活率明显减少。提示过表达miR-122a 可增强Hep-2 细胞对DOC 的敏感性。

表皮生长因子受体（EGFR）是受体酪氨酸激酶的家族成员，表达于细胞膜，通过与配体结合而磷酸化激活［7］。EGFR 在多种细胞行为中发挥重要作用，如细胞增殖、分化、细胞代谢、迁移、周期调控等［7］。活化的EGFR 能进一步磷酸化激活下游相关激酶通路，如MAPK、Akt 和JNK 通路，从而诱导细胞增殖［8］。研究显示，外源性干扰EGFR蛋白表达可明显增强肺癌A549细胞对化疗药物顺铂的敏感性［9］。提示抑制EGFR 与肿瘤细胞化疗增敏有关。本研究进一步实验发现，miR-122a 过表达后Hep-2 细胞p-EGFR 和p-AKT 蛋白表达明显下调。提示miR-122a 能抑制EGFR-AKT 信号通路活化，这可能是Hep-2 细胞对DOC 敏感性增强的潜在分子机制。

综上所述，miR-122a 可能通过抑制EGFR-AKT 信号通路增强Hep-2 细胞对DOC 的敏感性。本研究揭示了miR-122a 在喉癌细胞DOC 增敏中的可能机制，为临床治疗提供了一定的理论支持。但miR-122a 的下游信号机制还不够完善，有待于进一步研究。