透明质酸钠/ 植物鞘氨醇/ 三肽-1经皮共输送纳米载体屏障修复功效研究

王玉玲 罗丹 陈家铃 任姝静 张明浩 刘卫

通过体外细胞实验，研究透明质酸钠/植物鞘氨醇/三肽-1经皮共输送纳米载体对皮肤屏障的修复作用。采用细胞实验考察透明质酸钠/植物鞘氨醇/三肽-1纳米载体对角质形成细胞（HaCaT）的增殖能力，细胞迁移能力，细胞分泌丝聚蛋白、水通道蛋白3及紧密连接蛋白-1水平的影响。结果表明，与游离活性物比较，透明质酸钠/植物鞘氨醇/三肽-1纳米载体能显著提高HaCaT细胞增殖能力（P<0.05），增加HaCaT细胞迁移能力（P<0.01），且能显著促进HaCaT细胞分泌丝聚蛋白、水通道蛋白3及紧密连接蛋白-1水平（P<0.05）。说明透明质酸钠/植物鞘氨醇/三肽-1纳米载体具有修复皮肤屏障的作用，在新型高性能皮肤屏障修复护肤品领域具有良好的应用前景。

关键词：透明质酸钠，植物鞘氨醇，三肽-1，经皮输送纳米载体，屏障修复

皮肤作为人体重要的屏障，能够保护人体免受外界环境伤害和维持人体内环境稳态。皮肤屏障一旦受损，会导致锁水力下降、耐受力降低、外界有害物质刺激增加，从而使得湿疹、皮炎等皮肤疾病的发病率上升[1]。角质层作为一个连续性屏障，主要由角质细胞和细胞间脂质构成，角质形成细胞在角化过程中产生脂质并分泌至表层形成脂膜，角质形成细胞与胞外活性物紧密结合，形成初步的物理保护屏障[2]。

透明质酸钠（HA）对皮肤的作用主要取决于分子量大小。大分子HA主要用于皮肤的保湿，涂于皮肤表面的HA能软化皮肤的角质层，进一步增强皮肤角质层对活性物的吸收利用，使皮肤变得细腻光滑。小分子HA能透过正常皮肤屏障渗入真皮，直接促进细胞生长、分化、重建与修复，还可促进角质形成细胞的增殖和迁移[3，4]。

植物鞘氨醇为神经酰胺的前体，植物鞘氨醇不仅参与神经酰胺生成，同样具有促进人体表皮角化细胞分化作用[5]。三肽-1作为一种信号肽，具有促进细胞外基质如I和III型胶原蛋白，弹性蛋白，结构糖蛋白如层粘连蛋白和纤维连接蛋白的合成，能够促进皮肤组织更新重建[6]。

鉴于皮肤自有屏障功能的影响，上述活性成分难以透过角质层，在皮肤屏障内侧难以蓄积至有效浓度范围，导致皮肤屏障修复效果减弱甚至消失。采用经皮给药纳米载体技术，从保护皮肤屏障功能、补充细胞间脂质成分、促进角质层修复三大途径出发，将这三种途径的屏障修复活性成分同时包载于同一纳米载体中，可有效促进活性成分透皮吸收、提高其在皮肤中的储留量，实现不同作用机制活性成分的协同增效[7，8]。本研究构建透明质酸钠、植物鞘氨醇和三肽-1的经皮共输送纳米载体—屏障修复纳米载体，通过体外细胞实验对皮肤屏障修复功效进行系统研究和评价，以期为高性能的屏障修复功效护肤品开发提供实验依据。

01实验部分

1.1实验材料

透明质酸钠，华熙生物科技股份有限公司；植物鞘氨醇，韩国斗山；三肽-1，润辉生物技术（威海）有限公司；1，3-丙二醇，韩国B&B；卵磷脂，上海太伟药业股份有限公司；聚甘油-10油酸酯，日本日光化学。DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、青链霉素、胰酶，购自美国Gbico公司；CCK-8试剂盒，日本同仁化学；丝聚蛋白（FLG）、水通道蛋白3（AQP3）和紧密连接蛋白-1（Claudin-1）Elisa试剂盒，购自江苏酶免实业有限公司；人角质形成细胞（HaCaT），购自中国科学院昆明细胞库。

1.2实验仪器

高速剪切机，德国IKA公司；Zetasizer/Nano-ZS90纳米电位粒径分析仪，英国Malvern公司；AMH-3微射流高压均质机，安拓思纳米技术（苏州）有限公司；多标记酶标仪，美国PerkinElmer公司；AxioLabA1显微镜，蔡司中国公司；超净工作台，苏净集团安泰公司；BB150CO2培养箱，美国Thermo公司。

1.3实验方法

1.3.1屏障修复纳米载体的制备

称取适量植物鞘氨醇、聚甘油-10油酸酯和卵磷脂，45℃水浴加热溶解，得到油相；另称取透明质酸钠、三肽-1和1，3-丙二醇加到纯化水中，45℃水浴加热溶解，得到水相；将水相缓慢滴加至油相中并在45℃、800rpm的转速下搅拌30min，采用微射流高压均质机将混合溶液均质后，冷却至室温，得到屏障修复纳米载体。

1.3.2粒径、PDI与Zeta电位

取适量屏障修复纳米载体，超纯水稀释一定倍数，用纳米电位粒径分析仪测定粒径、多分散指数（Polymerdispersityindex，PDI）和Zeta电位，粒径测定角度为90°，测试温度为25℃。

1.3.3细胞毒性实验

收集对数生长期的HaCaT以1.5×104个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL，于5%CO2、37℃条件下培养24h。待细胞贴壁后，每孔分别加入100μL含有不同浓度的游离活性物和屏障修复纳米载体的DMEM完全培养基（对应HA浓度为0.2、1、5、25和125μg/mL），对照组仅加100μLDMEM完全培养基，每组3个复孔。继续培养24h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，孵育2h后于450nm处测量各孔的吸光度（A），计算细胞存活率。

1.3.4HaCaT细胞增殖实验

收集对数生长期的HaCaT以8×103个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL，于5%CO2、37℃条件下培养24h。待细胞貼壁后，每孔分别加入100μL含有不同浓度的游离活性物和屏障修复纳米载体的DMEM完全培养基（对应HA浓度为1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL），对照组仅加100μLDMEM完全培养基，每组3个复孔。继续培养48h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，孵育2h后于450nm处测量各孔的吸光度（A），计算细胞存活率。

1.3.5HaCaT细胞划痕实验

收集对数生长期细胞，调整HaCaT细胞密度为5×105个/mL，接种于6孔板中，培养过夜。用微量枪头在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分，用PBS冲洗划掉的部分，每孔分别加入含有游离活性物、屏障修复纳米载体的DMEM完全培养基（对应HA的浓度为5μg/mL），对照组仅加DMEM完全培养基在培养箱中孵育24h后，然后于倒置显微镜下观察划痕区细胞的愈合情况并拍照记录，采用ImageProPlus软件计算出划痕面积的平均值，计算划痕区愈合率。

1.3.6屏障修复相关因子检测实验

将HaCaT细胞以1×105个/mL的密度接种到24孔细胞培养板内，每孔500μL，于5%CO2、37℃条件下培养24h。每孔分别加入500μL含有不同浓度的游离活性物、屏障修复纳米载体的DMEM完全培养基（对应HA的浓度为1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL），对照组仅加500μLDMEM完全培养基，每组3个复孔，于5%CO2、37℃条件下培养48h后取上清液，用Elisa试剂盒测试FLG、AQP3及Claudin-1含量。

1.4数据统计与分析

数据结果采用SPSS20.0软件进行统计学处理，所有数据均采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，使用ANOVA法评估两组结果差异，P<0.05被认为有统计学差异。

02结果与讨论

2.1理化性质表征

采用纳米电位粒径分析仪测得屏障修复纳米载体粒径为134.2±1.3nm，PDI为0.271±0.014，Zeta电位为-18.2±1.5mV，屏障修复纳米载体的粒径分布见图1。

2.2对HaCaT细胞安全性影响

表皮角质形成细胞是构成皮肤表皮层的主要细胞类型，并且具有表皮构成、创伤修复、细胞角化、细胞因子分泌和免疫监视等功能，常被用于生物医学领域作为体外皮肤研究的细胞系，对皮肤屏障修复具有显著影响[9]。采用CCK-8法检测评价屏障修复纳米载体安全性，并为后续实验确定合适的给药剂量。

如图2所示，当屏障修复纳米载体中HA浓度在0.2～125μg/mL范围内，游离活性物和屏障修复纳米载体组HaCaT细胞活性均在80%以上，无明显细胞毒性。但HA浓度在125μg/mL时，屏障修复纳米载体HaCaT细胞存活率降低，后续实验选择的HA浓度为1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL。

2.3促进HaCaT细胞增殖

将不同浓度的游离活性物与屏障修复纳米载体处理HaCaT细胞48h后，采用CCK-8法检测HaCaT细胞存活率变化见图3。

如图3所示，与空白对照比较，游离活性物和屏障修复载体均能促进HaCaT细胞增殖（P<0.05或P<0.01）；与游离活性物比较，HA浓度为5μg/mL和25μg/mL时，屏障修复载体对HaCaT细胞具有明显的促增殖作用（P<0.05或P<0.01），说明屏障修复载体能促进HaCaT细胞增殖，且效果优于同浓度游离活性物。

2.4促进HaCaT细胞迁移

在伤口愈合的早期阶段，表皮中角质形成细胞被激活，并迁移到创伤部位诱导伤口收缩，接着进行细胞增殖以皮肤修复重建，因此，角质形成细胞对于伤口愈合有重要作用[10]。采用细胞划痕实验，比较0h和24h划痕面积变化，探讨游离活性物和屏障修复纳米载体对HaCaT细胞迁移能力的影响，结果见图4。

如图4所示，在HaCaT细胞中，HA浓度为5μg/mL时，与空白对照组比较，游离活性物和屏障修复纳米载体均能极显著增加HaCaT细胞迁移率（P<0.01），与游离活性物组比较，屏障修复纳米载体均能极显著增加HaCaT细胞迁移率（P<0.01），说明复合屏障修复载体能够显著促进HaCaT细胞的迁移融合，具有良好的皮肤屏障修护效果，且效果优于同浓度游离活性物。

2.5提高屏障修复因子FLG水平

FLG分布于表皮颗粒层和透明层，对维持角质层的物理强度和阻止外来抗原侵入至关重要。FLG可促进表皮分化，在FLG单体协助连接下，角蛋白成纤维束有规则地聚集，进而引起细胞紧密的状态，形成表皮角质层的屏障结构，其降解可形成天然保湿因子[11]。采用ELISA法检测屏障修复纳米载体对HaCaT细胞外基质中FLG的影响，结果见图5。

如图5所示，与空白对照比较，游离活性物和屏障修复纳米载体均能极显著促进HaCaT细胞分泌FLG（P<0.01）；HA浓度1μg/mL、5μg/mL时，与游离活性物比较，屏障修复纳米载体促进HaCaT细胞分泌FLG水平显著提高（P<0.05或P<0.01）。

2.6提高屏障修复因子AQP3水平

AQPs是角质形成细胞中与水分子通透性有关的一个跨膜转运蛋白通道，AQP3可将水分、甘油、甘油三脂转运至表皮，保持表皮水分，对皮肤屏障修复、保湿具有积极作用[12]。采用ELISA法检测屏障修复纳米载体对HaCaT细胞外基质中AQP3的影响，结果见图6。

如图6所示，与空白对照比较，游离活性物HA浓度5μg/mL、25μg/mL时，屏障修复纳米载体HA浓度1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL时，HaCaT细胞分泌AQP3含量显著提高（P<0.05或P<0.01）。HA浓度1μg/mL时，与游离活性物比较，屏障修复纳米载体促进HaCaT细胞分泌AQP3水平显著提高（P<0.01）。

2.7提高屏障修复因子Claudin-1水平

紧密连接蛋白包括Claudin家族蛋白、闭合蛋白Occludin、连接黏附分子家族蛋白以及紧密连接斑块蛋白，对于维持表皮细胞的选择渗透性屏障功能至关重要。其中，Claudin-1是构成紧密连接结构最重要的组成活性物，与多种皮肤疾病的发生息息相关[13]。采用ELISA法检测屏障修复纳米载体对HaCaT细胞外基质中Claudin-1的影响，结果见图7。

如图7所示，与空白对照比较，游离活性物HA浓度5μg/mL、25μg/mL时，屏障修复纳米载体HA浓度1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL时，HaCaT细胞分泌Claudin-1含量显著提高（P<0.01）。HA浓度25μg/mL时，与游离活性物比较，屏障修复纳米载体促进HaCaT细胞分泌Claudin-1水平显著提高（P<0.05）。

03结论

本研究制备的屏障修复经皮共输送纳米载体包含透明質酸钠、植物鞘氨醇和三肽-1三种主要活性成分，按照屏障修复作用机制进行配伍，协同增效。体外细胞实验结果证明，屏障修复纳米载体对HaCaT细胞安全无毒性，与游离活性物比较，屏障修复纳米载体可促进HaCaT细胞增殖及细胞迁移，且能增加HaCaT细胞分泌屏障相关因子FLG、AQP3和Claudin-1的水平。本研究提示，透明质酸钠、植物鞘氨醇和三肽-1等活性成分经纳米载体包裹后得到的屏障修复经皮共输送纳米载体，在高性能屏障修复化妆品产品中具有良好的应用前景。