茶叶中真菌毒素检测研究进展

吕志强 张滢

摘要：茶因其口感独特并含有多种有益健康的活性成分而深受消费者青睐，已成为世界上消费最多的饮品之一。然而，茶叶在种植、采摘、加工、储存和运输过程中存在被真菌毒素污染的风险，对人类健康造成威胁。文章从近5 年文献报道的各类茶叶中真菌毒素的检测方法和检测结果进行综述，旨在为茶叶质量安全监督提供参考。

关键词：茶叶；真菌毒素；检测；研究进展

中图分类号：TS272；TS201.6   文献标识码：A   文章编号：1000－3150 （2023） 05-12-9

因茶及其制品含有多种对健康有益的成分，能预防如癌症、糖尿病、肥胖和心脑血管疾病等[1-3]，所以深受国内外消费者的青睐，已成为世界上消费最多的饮品之一。然而，有不少研究报道茶存在被真菌毒素污染的风险[4-8]，引起了社会的广泛关注和消费者的诸多疑虑。真菌毒素是广泛分布于食品中的产毒真菌的次级代谢产物，其物理化学性质稳定，在食品加工处理过程中很难被破坏，经食物链进入人体后可造成潜伏、慢性和急性毒性，具有较强的致畸、致癌、免疫抑制、神经毒性和肝肾毒性等毒副作用，严重威胁着人类的健康[9-10]。世界卫生组织已将真菌毒素纳入食品安全体系重点监测对象，我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017） 已对部分食品中的真菌毒素做了限量规定，但未涉及茶叶制品[11]。由于茶叶生产链长，在种植、采摘、生产加工、运输及贮藏过程中均可能受到产毒真菌的污染，产毒真菌在适宜的环境下繁殖产毒，导致真菌毒素不断累积[12]，因此，很有必要对茶叶中真菌毒素进行监测。

1 茶叶中真菌毒素的检出现状

目前已知的真菌毒素有400 余种，茶叶中常见的主要包括黄曲霉毒素（AFs）、赭曲霉毒素（OTA）、伏马毒素（FBs）、T-2 毒素（T-2）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、柄曲霉素（STC） 和橘青霉素（CIT）等[13-14]。成分复杂的茶基质（含有多酚、咖啡碱、氨基酸、嘌呤生物碱、皂苷、黄酮醇及其苷等成分） 势必会对检测造成干扰，这使茶叶中真菌毒素的检测更具挑战性[4，15-16]，此外真菌毒素在低浓度水平就能引发毒性反应，所以前处理方法的适用性，检测方法的灵敏度、准确度及选择性显得尤为重要，会显著影响检测结果[17]。

1.1 未发酵茶、微发酵茶及半发酵茶中真菌毒素检出概况

根据制作工艺，绿茶属于未发酵茶，微发酵茶一般指白茶和黄茶，而乌龙茶（青茶） 属于半发酵茶。

王鹭等[18]采用固-液萃取结合超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS） 对20 份茶叶（绿茶4份、红茶6 份、普洱茶7 份、青茶3 份） 进行8 种真菌毒素的检测，在2 份绿茶和1 份青茶中检出黄曲霉毒素B2 （AFB2）。Mannania 等[19]对从摩洛哥3个地区（EI Jadida，Kénitra 和Meknès） 收集的129份绿茶中的黄曲霉毒素B1 （AFB1）、AFB2、黄曲霉毒素G1 （AFG1）、黄曲霉毒素G2 （AFG2） 进行了研究， 以固- 液萃取提取样品， 三氟乙酸（TFA） 进行AFs 衍生化，高效液相色谱串联荧光检测器法（HPLC-FLD） 进行定量分析，液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS） 对可疑样品进行确认，结果检出76 份样本阳性。Jai 等[20]运用LC-MS/MS对111 份绿茶中的15 种真菌毒素进行筛查，提取方法为改进的液-液微萃取法（DLLME），检出的真菌毒素包括交链孢酚（AOH）、ZEN、AFG1、AFB2、恩镰孢菌素（ENB） 和腾毒素（TENT）。Pakshir 等[21]采用免疫亲和柱（IAC） 结合HPLCFLD检测15 份绿茶中AFs 和OTA 的含量，结果2份检出AFB1，11 份检出OTA。Kiseleva 等[22]采用UHPLC-MS/MS 对俄罗斯市售的多种茶叶中的29种真菌毒素进行了筛查，提取方法为固-液萃取，离心后取上清液直接分析，结果在未包装的4 份绿茶中有1 份检出了霉酚酸（MPA） 和博维霉素（BEA），在具有包装的4 份绿茶中有1 份检出T-2，3 份检出MPA，2 份检出BEA，2 份检出乙酰基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇（AcDON）。Reinholds 等[23]以固-液萃取结合固相萃取柱（SPE） 为前处理方法，采用二维液相色谱串联飞行时间质谱法（2DLC-TOF-MS） 在43 份绿茶中检出了AFB1、柄曲霉素（STC）、OTA、DON、3-AcDON、T-2、HT-2 和互隔交链孢霉素（ALT）。刘文静等[24] 采用QuEChERS 法（快速、容易、廉价、有效、坚固、安全） 结合SPE 对茶叶进行前处理，UPLC-MS/MS检测，结果显示在福建各地区共计121 份陈年老茶（乌龙茶38 份、白茶53 份、红茶30 份） 中仅有1 份乌龙茶被检出AFB1。Areo 等[25]从南非市场上收集了100 份茶叶（包括天然茶、香料茶、草药茶、绿茶、红茶、乌龙茶和白茶），采用QuECh-ERS 法结合UPLC- MS/MS 进行AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA和ZEA的筛查，结果26 份被检出AFG1 （1.72～5.19 μg/kg）。Zhou 等[26]在自制纯化柱的基础上结合UPLC-MS/MS 开发了一种简便的用于茶中16 种真菌毒素检测的方法，结果显示20 份绿茶和20 份乌龙茶中检出的主要真菌毒素包括AFs、α- 玉米赤霉烯醇（α-ZEL）、β-ZEL、DON和CIT。

1.2 全发酵茶（红茶） 中真菌毒素检出概况

红茶是以适宜的茶树鲜叶经萎凋、揉捻、发酵、干燥等工艺加工而成，茶叶中的化合物在加工过程中经历了复杂的化学反应，如茶多酚在多酚氧化酶作用下氧化聚合形成茶黄素、茶红素和茶褐素等，从而形成了紅茶的独特风味[27]。虽然在红茶的发酵过程中并没有微生物参与，但仍有不少文献报道在红茶中检出多种真菌毒素。

王鹭等[18]检测的6 份红茶中有2 份分别检出AFG1 （印度产） 和AFB2 （南非产）。Toman 等[28]运用HPLC-FLD 对土耳其红茶中OTA的含量及茶汤的转移率进行了研究，在50 个样本中检出4 个阳性，OTA 从红茶到茶汤的转移率为（41.5 ±7.0）%。Carraturo 等[29]应用IAC结合HPLC-FLD在32 份茶样中检出11 份红茶和11 份绿茶含有OTA，冲泡过程中OTA 的转移率红茶为（33.65 ±4.37）%， 绿茶为（54.47 ± 14.48）%。Gazioglu等[30]运用酶联免疫吸附测定法（ELISA） 测定了土耳其多种食品中的OTA，其中红茶中OTA的最高含量为139.5 μg/kg。Garbowska 等[31]收集了波兰市场上流行的红茶、绿茶、黑茶，每种茶各5 种品牌，用1.5 g 茶叶制备成200 mL茶水，经IAC 处理后，运用HPLC-FLD 在红茶中检出了OTA。Pakshir等[21]评估的45 份红茶中有18 份被检出AFs；41份被检出OTA。Reinholds 等[23]在63 份红茶中检测到了DON、3-AcDON、15-AcDON、OTA、ALT以及较低浓度水平的AFs，但其中两个样本的AFs含量较高，一个是肯尼亚的散装红茶，AFB1 和AFB2 的含量分别为13.90 μg/kg 和12.10 μg/kg；另一个印度香料红茶中AFB1 为39.00 μg/kg，AFB2为11.10 μg/kg， AFG1 为41.70 μg/kg， AFG2 为9.95 μg/kg， AFB1 和AFG1 是该样本中AFs（101.75 μg/kg） 的主要毒素。刘文静等[24]检测的30份红茶中有1 份检出了OTA。Zhou 等[26]在20 份红茶中检测到了AFs、α-ZEL、β-ZEL、DON、15-AcDON 和CIT。Abbasi 等[32]运用IAC 结合HPLCFLD对40 份从印度、斯里兰卡、肯尼亚和越南进口到Bushehr 港的红茶进行了AFB1 检测，结果显示肯尼亚和越南的红茶中的AFB1 的含量分别为（24.33±1.52）ng/g和（42.66±3.05） ng/g。Zhao 等[33]改进了QuEChERS 法，运用LC-MS/MS 建立了一种简单、快速、灵敏、可靠的分析方法，对从中国不同市场上随机采集的126 份茶叶的AFB1 和STC进行分析，结果未检出AFB1，但在17 份样本中检测到了STC，红茶、绿茶和乌龙茶中STC 的检出率分别为5%、8.9%和33.3%。

1.3 后发酵茶中真菌毒素检出概况

后发酵茶是由酶、微生物和湿热三者综合作用而得，主要包括湖南黑茶、湖北青砖茶、四川边茶、安徽古黟黑茶、云南普洱茶、广西六堡茶及陕西黑茶。渥堆发酵在后发酵茶独特风味和口感的形成中起着至关重要的作用，但大量微生物参与发酵过程导致其被真菌毒素污染的风险大大增加[34]。

Zhang 等[35]以固-液萃取结合LC-MS/MS为检测方法，结果显示15 份生普洱茶中有9 份检出展曲霉素（PAT），16 份熟普洱茶中有2 份检出PAT。姚婷等[36]以固-液萃取结合IAC 为前处理方法，运用UPLC-Q-TOF-MS （超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法） 建立了黑茶中AFB1 的快速分析方法，在市售的33 种黑茶中均检出了AFB1，并发现样品的年份越久，仓储时间越长，AFB1 含量越高。刘妍等[37]采用固-液萃取和QuEChERS 处理样品， 结合UPLC- MS/MS 建立了黑茶中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、3-AcDON、ZEN、T-2、HT-2和OTA的简单、快速、高灵敏度的检测方法，对市售的61 份茶样品（云南普洱茶30 份、湖南黑茶15 份、广西六堡茶10 份和湖北老青茶6份） 进行了定量与定性分析，结果发现7 份普洱茶和2 份黑茶被检出AFB1，1 份普洱茶和2 份黑茶被检出DON，2 份普洱茶和3 份黑茶被检出OTA。胡琳等[38]采用固-液萃取结合IAC 处理样品，运用UPLC-MS/MS 研究建立了云南普洱茶中16 种真菌毒素的检测方法，在174 份普洱茶中检出了FB1、FB2、FB3 和DON。Bogdanova 等[39]以固-液萃取和SPE为前处理方法，运用在线二维多中心切割液相色谱- 飞行时间质谱（Online- heart- cutting- 2DHPLC-TOF-MS） 研究開发了同时检测普洱茶中潜在的70 种真菌毒素的分析方法，在从Latvian 市场和茶馆收集的20 份普洱茶中检出的真菌毒素包括：DON、3-AcDON、15-AcDON、脱氧雪腐镰刀菌烯醇- 3- 葡萄糖苷（D3G）、赭曲霉毒素B（OTB）、恩镰孢菌素A （ENNA）、恩镰孢菌素B（ENNB）、ALT、AFB1、AFG1、STC、T- 2 和ZEN。Cui 等[40]研究开发了一种基于IAC 和LC-MS用于定量分析黑茶中4 种AFs 的快速分析方法，在158 份黑茶中检出1 份康庄茶含有AFB1，1 份福庄茶含有AFB1、AFB2、AFG1 和AFG2。Li 等[41]同时采用HPLC-FLD 和UPLC-MS/MS 对六堡茶中潜在的产毒真菌和CIT 进行了研究，在113 份六堡茶样品中有32.7%的样品检出CIT，并得出六堡茶中CIT 的浓度高低受储藏气候条件和水分活度影响较大的结论，水分活度高时有利于产毒真菌增殖和真菌毒素的产生。Ye 等[42]研究开发了一种多功能柱-免疫亲和柱（MFC-IAC） 作为前处理方法，运用高效液相色谱串联荧光和紫外检测器法（HPLCFLD-UV） 对108 份中国黑茶进行了6 种真菌毒素的筛查，结果只有ZEN 和OTA被检出。Li 等[43]运用HPLC-UV 和GC?MS 开发了检测多种茶中PAT含量的方法，对7 类共219 份中国茶叶进行筛查，其中17 份普洱茶和38 份黑茶被检出PAT。Zhou等[26] 在20 份黑茶中检测到了AFs、α- ZEL、β-ZEL、DON、OTA 和CIT。Gholizadeh 等[44]首次采用超声辅助混合溶剂提取法结合磁性离子液体辅助分散液-液微萃取法（UA-MSE-MIL-EA-DLLME）作为从茶样品中提取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和OTA 的方法，再结合HPLC-FLD 进行检测，在研究的15 份黑茶中均检出了AFB1，2 份样品检出了AFG1，5 份样品检出了OTA。Chen 等[45]研究建立了六堡茶中CIT的相关合成基因，采用聚合酶链式反应（PCR） 和HPLC-FLD对六堡茶不同生产阶段的真菌产毒能力和CIT 含量进行了分析。结果显示17 个样品在发酵过程中均被检出CIT，早期（发酵5 d） 和中期（发酵25 d） 的含量最高，分别为86.75 μg/kg 和96.25 μg/kg；PCR结果显示发酵过程中CIT生物合成基因的Ct 值均小于33.5，表明CIT 污染为高风险，而老化过程中仅2 个样品被检出CIT （24.75、24.00 μg/kg），且Ct 值在老化过程中显著升高，说明CIT生物合成途径受到抑制。

2 茶叶中真菌毒素的检测方法

表1 汇总了以上文献报道的茶叶中真菌毒素的检测方法及评价指标。茶叶基质的复杂性使前处理在检测中显得至关重要，以上综述的研究中应用较多的是固-液萃取、液-液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、QuEChERS 以及IAC，有些研究对以上方法进行优化和改进，如超声辅助混合溶剂提取法与磁性离子液体辅助分散液-液微萃取法、悬浮固化分散液液微萃取法（DLLME-SFO） [46]、MFCIAC以及将两种SPE 柱联用以达到更好的净化效果； 真菌毒素的分析方法主要包括HPLC-FLD（UV 或DAD）、LC （UPLC） - MS/MS、ELISA、电化学法传感器法和高光谱成像法等[47]，其中应用于茶叶的主要包括HPLC-FLD 和UPLC-MS/MS。一些特异性强、灵敏度高、快速简便的方法，如ELISA 和PCR 也有应用，但其选择性、精密度和准确性还有待提高，易出现假阳性结果；虽然HPLC-FLD的灵敏度、精密度和准确度较高，但应用范围窄，不是所有的目标化合物在选择的条件下都能发生荧光，且易受干扰，易出现假阳性，对前处理要求较高[15]。LC （UPLC） -MS/MS 具有选择性强、灵敏度高、精密度好、准确性高、高通量和假阳性率低等优点，既能定性和定量，又能同时测定多种真菌毒素，在以上综述的研究中应用也最多。

3 茶叶中真菌毒素的检测结果及风险评估

3.1 检测结果

表2汇总了以上文献报道的茶叶中真菌毒素的具体检测结果。综上而言，绿茶中检出频次较多的真菌毒素包括AFB1 （0.46～41.80 μg/kg）、AFB2（1.20～75.40 μg/kg） 和OTA （0.54～20.35 μg/kg），同時AFG1、AFG2、DON、3-AcDON、AcDON、T-2、STC、ZEN、TENT、ALT、α-ZEL、β-ZEL、ENB、AOH、MPA、PAT和CIT在部分绿茶中被检出。对乌龙茶、白茶和黄茶的研究相对较少。红茶中检出频次较多的包括AFB1 （0.39～42.66 μg/kg）、AFG1（4.60～41.70μg/kg）和OTA（0.35～139.50μg/kg），同时在部分红茶中检出了CIT、DON、3- Ac-DON、15- AcDON、α- ZEL、β- ZEL、ALT 和STC。尽管红茶和绿茶中检出频次较多的真菌毒素相似，即AFs 和OTA，但从含量水平看，红茶中OTA的含量高于绿茶，而绿茶中AFs 的含量比红茶略高，同时绿茶中检出的真菌毒素种类比红茶多。后发酵茶与微生物的关系最为密切，因此被检出阳性的可能性较大，如在普洱生茶中检测到的PAT平均含量为1 169 μg/kg，在来源于拉脱维亚的茶样中DON 含量范围为145～8 946 μg/kg，3-AcDON 含量范围为145～4 197 μg/kg，15-AcDON含量范围为113～3 601 μg/kg。黑茶中检测到的OTA 含量范围为0.30～11 354.64 μg/kg，CIT 含量范围为7.80～206.10 μg/kg，此外OTB、D3G、ENNA、ENNB、ALT、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、FB1、FB2、FB3、STC、T- 2、ZEN、α-ZEL、β-ZEL 在部分后发酵茶中均有检出。另外，同种类茶叶中所检出的真菌毒素的种类和含量在不同研究中差异较大，这可能与茶叶原料、加工、包装、运输及储存环境（如温度、气候、湿度等） 等因素存在差异有关。

3.2 风险评估

目前针对茶叶中真菌毒素限量标准，仅有印度规定了红茶中AFs限量为30.00 μg/kg，阿根廷规定了凉茶冲泡原料中AFB1和AFs限量为5.00 μg/kg和20.00 μg/kg，以及关税同盟国（亚美尼亚、白俄罗斯、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦和俄罗斯） 规定了普洱生茶中AFB1 限量为5.00 μg/kg[12，14]。我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》（GB2761—2017） 已对部分食品中的真菌毒素做了限量规定，但未涉及茶叶制品。另外，通过饮茶摄入人体的真菌毒素的量能否危害人体健康还缺乏足够的研究数据。Ismail 等[5]评估了通过饮用巴基斯坦木尔坦市的品牌和非品牌红茶所摄入的AFs的EDI （估计的每日摄入量），结果并没有样本超过TDI （每日最大耐受量），但对经常大量摄入茶叶的消费者来说，毒性的可能性仍然存在。Jai 等[20]评估了绿茶中ZEN、AOH、ENB 和TENT 的PDI（可能的每日摄入量），与TDI比较后得出通过饮用来自摩洛哥的绿茶而摄入的真菌毒素对消费者并没有安全风险。Reinholds 等[23]假设了最坏的情况，即以茶叶中发现的真菌毒素完全转移到茶汤中为前提进行风险评估，结果显示OTA和DON的PDI 分别为TDI 的0.88% ～2.05% 和2.50% ～78.9%，表明所检测的茶叶对消费者是安全的。Ye等[42]对昆明、普洱和乌兰巴托3 个地区不同年龄和性别群体进行6 种真菌毒素的膳食风险评估，确定性风险评估和概率估计显示3 个地区饮用黑茶没有健康风险。Li 等[43]通过对多种类型茶中的PAT进行的大量调查表明，PAT只出现在少量茶样品中，且总体浓度较低，即使是饮用大量浓茶也不会导致摄入危险剂量的PAT。

4 展望

以上综述的研究主要是以茶叶为研究对象，而实际生活中人们食用的是用茶叶冲泡或制备的茶饮品，茶饮品中真菌毒素的含量可直接反映饮用者的暴露风险，因此，在制备茶饮品时真菌毒素的转移率及茶饮品中真菌毒素的含量是值得重点研究的方向[48-49]。目前，针对茶叶中真菌毒素的膳食风险评估的数据还相当有限，且主要参考其他食品的评估方法，这并不符合饮茶的特点（开水冲泡、饮用茶汤、弃去茶渣），因此应研究完善其风险评估方法以得到更科学准确的结论。部分文献的研究结果显示在所检测的茶样品中并未检测到真菌毒素[50-51]，这除了与检测方法有关外，也说明并不是所有的茶叶都会被污染，通过控制加工条件、选择适宜的包装和保障流通环节适宜的温湿度等可有效降低被污染的风险。同时，期望我国能尽早制定茶叶中真菌毒素的检测标准及限量规定，为提高我国茶叶的质量、防止茶叶出口受到贸易壁垒及保障消费者的饮食安全提供有力的技术支持。