阴茎组织剪切波超声弹性量化测值与Ⅲ型胶原纤维含量的相关性分析

饶宛婷 申宜昊 陶秀红 邢晋放

实时剪切波超声弹性成像（real time shear wave elastography， RT-SWE）技术是一项新型超声弹性成像技术，具有无创、定量、操作简便和重复性高的特点［1］。RT-SWE 的基本原理是通过捕获被测组织产生的横向剪切波，生成反映组织弹性特征的二维分布图并实时成像；通过测定横向剪切波在感兴趣区（region of interest， ROI）内的传播速度（shear wave velocity， SWV），推算出剪切波弹性量化测值（shear wave elastic quantitative measurement， SWQ）［2-3］。由于横向剪切波所经过的组织成分及其含量直接决定SWV 的大小，因此，SWQ 与探查组织的成分及其含量存在密切关系。

胶原纤维是阴茎组织中最主要的细胞外基质成分，约占40%～65%，在维持阴茎勃起过程中发挥着主要作用［4］。大鼠阴茎组织中包含的胶原纤维类型有Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型，其中以Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维为主［5］。Ⅲ型胶原纤维是参与阴茎拉伸过程的基本组织成分，且参与组织损伤的修复过程［6］，准确评价阴茎组织内Ⅲ型胶原纤维的含量具有重要临床意义。目前，临床尚无定量评价Ⅲ型胶原纤维含量的无创方法。根据RT-SWE基本原理进行理论分析：Ⅲ型胶原纤维作为阴茎组织内的主要成分，其含量与SWQ存在相关性。故本研究旨在通过实验验证阴茎组织SWQ与Ⅲ型胶原纤维的含量是否存在相关性，为利用RTSWE定量评价阴茎组织内胶原纤维含量奠定必要的实验基础。

方 法

1.主要试剂

5%戊巴比妥钠（国药集团上海化学试剂有限公司）；Anti-Collagen Ⅲ（美国Abcam 公司，No.ab6310）；即用型MaxVisionTM检测试剂盒（上海迈新生物技术有限公司）；柠檬酸组织抗原缓冲液（上海迈新生物技术有限公司）；苏木精染液（上海迈新生物技术有限公司）；伊红染液（上海迈新生物技术有限公司）；甲醛液（上海信帆生物科技有限公司）；无水乙醇（国药集团上海化学试剂有限公司）；二甲苯（国药集团上海化学试剂有限公司）；H2O2（国药集团上海化学试剂有限公司）。

2.成像仪器

Aixplorer 超声诊断仪（美国HOLOGIC 公司）；探头型号为SL 15-4（美国HOLOGIC公司）。

3.实验动物

20只清洁级雄性SD大鼠，5～60周龄，体重110～450 g，由复旦大学附属浦东医院实验动物中心提供和笼养。大鼠均在相同室温、相对湿度环境下同步饲养1周，自由进食和饮水。实验操作符合复旦大学附属浦东医学中心伦理委员会对动物实验伦理的要求。

4.RT-SWE检查

大鼠称重，戊巴比妥钠（剂量30 mg/kg）腹腔注射麻醉。待大鼠翻正反射消失后，取仰卧位，固定头部和四肢，以充分暴露大鼠阴茎。所有大鼠的RTSWE 检查均由同一高年资超声医师完成。取大鼠阴茎横切面进行灰阶超声扫查，待阴茎组织的解剖图像显示清晰后，将成像模式切换至SWE，主要仪器设置“图像优化”调节为“Pen”，调整取样框的大小使其大于阴茎横切面；选择阴茎中部的横切面进行RTSWE检查，在图像质量最佳时连续存储图像30 s。

5.SWQ测量

回放图像，选取阴茎组织内色彩充填完整、稳定且无马赛克样干扰斑点的RT-SWE 图像进行SWQ 测量。将圆形ROI放置于阴茎组织内，调整其直径使最大范围包绕阴茎且边缘不超过阴茎包膜。测量ROI内大鼠阴茎组织SWQ的均值“Mean”，单位选择kPa。

6.免疫组化分析

完成RT-SWE检查后即刻对大鼠实施安乐死，从阴茎根部剪断阴茎组织并将其置于4%中性甲醛液中固定24 h。取出固定液中阴茎组织，擦干后置无水乙醇中30 min 进行脱水处理；随后将其放入石蜡中进行包埋，并制成5 μm切片，于45℃恒温箱中烘干后，使用二甲苯和无水乙醇对切片进行脱蜡处理。向修复盒中滴加柠檬酸组织抗原缓冲液（pH 6.0），并将切片放入修复盒中，于95℃微波辐射10 min。待修复液冷却至室温后，使用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline， PBS）漂洗3 次，每次5 min，以修复抗原。滴加3% H2O2于室温下孵育10 min，以灭活内源性过氧化物酶；滴加Anti-Collagen Ⅲ（1∶50）一抗稀释缓冲液，并放入4℃冰箱内孵育过夜，次日使用PBS 漂洗3 次，每次5 min；滴加即用型MaxVisionTM试剂于室温条件孵育15 min，使用PBS 漂洗3 次，每次5 min；滴加二氨基联苯胺于室温下进行显色反应；苏木精复染，分级乙醇脱水，二甲苯透明后封片。

光镜下（×200倍）观察每张切片，随机选择3个阳性细胞均匀的视野，分析组织切片中Ⅲ型胶原纤维的阳性面积百分比（positive area percentage， PAP），并计算其平均值。

7.统计学方法

使用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。采用单样本Kolmogorov-Smirnov 检验分析SWQ 和PAP 是否符合正态分布，符合正态分布的数据以均数±标准差表示，不符合正态分布的数据则以中位数（四分位间距）表示。根据正态性检验的结果选择Pearson 或Spearman 秩和检验分析SWQ 与PAP 间的相关性。双侧P＜0.05被认为具有统计学意义。

结 果

1.RT-SWE检查

成功完成20 只大鼠阴茎组织的RT-SWE 检查和SWQ 测量，所有大鼠的RT-SWE 图像质量均符合SWQ 的测量要求。大鼠阴茎组织横切面RT-SWE 图像特征（图1）：灰阶图像显示阴茎横切面呈圆形，边界清晰，包膜完整，内部为均匀低回声；RT-SWE图像显示阴茎组织内色彩充填完整且无马赛克样干扰斑点；SWQ 测量结果包括最大值、最小值、平均值和标准差。所有大鼠阴茎组织SWQ的Mean测值范围为5.80～11.10 kPa，平均值为（8.83±1.53）kPa。

图1 大鼠阴茎RT-SWE图像

2.胶原纤维的免疫组化分析

大鼠阴茎组织内Ⅲ型胶原纤维的表达情况如图2所示：切片内的棕色区域代表阳性（Ⅲ型胶原纤维）。所有大鼠阴茎中部组织PAP 的中位数（四分位间距）为6.5%（16.3%），测值范围为1.2%～29.6%。

图2 大鼠阴茎组织内Ⅲ型胶原纤维的表达情况（×200）

图3 大鼠阴茎组织SWQ与PAP的相关性

3.SWQ与PAP的相关性分析

单样本Kolmogorov-Smirnov 检验结果：大鼠阴茎组织的SWQ 符合正态分布（P=0.200＞0.05），而PAP 不 符 合 正 态 分 布（P=0.008＜0.01）。故 选 择Spearman 秩和检验对SWQ 与PAP 进行相关性分析，结果显示：SWQ 与PAP 显著相关（P＜0.001），相关系数r为-0.771（图3）。

讨 论

RT-SWE 是一项新型无创超声检查技术，能够客观、定量显示组织的弹性特征，重复性高且操作简便［1］。RT-SWE 成像的基本原理为：探头发射的声辐射力脉冲在被测组织不同深度上连续聚焦，可使被测组织受到机械激励以产生横向剪切波。RT-SWE 超声系统通过探头快速捕获被测组织产生的横向剪切波，将其进行编码处理后转换为可反映组织弹性特征的二维分布图并实时成像；通过精确测量ROI内横向剪切波的SWV（m/s），根据公式E=3ρcs2（E 为SWQ，ρ为组织密度，cs为SWV），可推算出反映剪切波所经过组织弹性特征的客观指标——SWQ（kPa）［2-3］。故横向剪切波所经过的组织，其成分和含量的改变可直接影响SWQ 的大小，并通过RT-SWE 进行客观定量显示。

胶原纤维是阴茎组织中最主要的细胞外基质成分，约占40%～65%，在维持阴茎的正常勃起过程中具有重要的作用［4］：胶原纤维的纤维支架样结构能够防止阴茎在勃起过程中出现变形、弯曲，保证阴茎的正常勃起［5］；能够防止基底膜和平滑肌细胞过度拉伸，避免内皮细胞及其下细胞层在勃起过程中出现破裂［7］；纤维鞘结构能够保护阴茎内的血管和神经，避免在勃起过程中出现动脉塌陷和神经受压［8］。研究证明，衰老、高血压、糖尿病、睾酮缺乏、阴茎损伤（例如过度摩擦）等因素均会导致阴茎组织内胶原纤维的含量发生变化，最终导致勃起功能障碍（erection dysfunction， ED）［9-11］。

大鼠阴茎组织中含有Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型等多种类型的胶原纤维，以Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维为主［5］。其中，Ⅲ型胶原纤维具有较高的顺应性，是参与阴茎拉伸过程的基本组织成分［6］。此外，Ⅲ型胶原纤维主要参与组织损伤的早期修复过程：在损伤刺激下，成纤维细胞增多，部分转化为肌成纤维细胞，合成Ⅲ型胶原纤维，以促进瘢痕愈合，提高抗撕裂强度［12］。Ⅲ型胶原纤维含量的过度增加会引起纤维斑块的挛缩和阴茎的勃起畸形，是阴茎组织纤维化病变的主要特征，故准确评价阴茎组织内Ⅲ型胶原纤维的含量具有重要的临床意义。

目前，组织活检技术仍是临床上可定量分析阴茎组织成分的唯一方法。然而此方法具有创伤性，且对操作者的技术要求较高，患者在活检术后易出现阴茎血肿、硬结和疼痛等并发症；此外，由于该器官具有私密性和功能保护的特殊性，阴茎组织活检技术临床应用严重受限。而常规灰阶超声检查主要显示阴茎组织病变的形态学变化，无法评价阴茎组织内Ⅲ型胶原纤维的含量。初步研究发现，RT-SWE 技术可用于阴茎海绵体硬度的评价、动脉性ED 和非动脉性ED 的鉴别以及阴茎硬结症的诊断［13-15］。由于Ⅲ型胶原纤维含量的变化能够影响阴茎组织的弹性特征，据此，作者推测阴茎组织SWQ 与Ⅲ型胶原纤维含量具有相关性。

本研究通过免疫组化方法测得Ⅲ型胶原纤维的PAP，并与RT-SWE 所测得的SWQ 进行相关性分析，结果显示两者有显著相关性（r=-0.771，P＜0.001）。这一研究结果提示，阴茎组织内的胶原纤维是影响SWQ 的主要成分，通过测量阴茎组织的SWQ 可以定量分析阴茎组织内的Ⅲ型胶原纤维含量。

综上所述，阴茎组织的SWQ 与Ⅲ型胶原纤维具有相关性，可作为定量评价阴茎组织内Ⅲ型胶原纤维含量的客观指标，因此RT-SWE有望成为一种定量评价阴茎组织胶原纤维含量的无创新方法，有益于提高临床诊断阴茎组织病变的精确度，值得深入探讨与研究。