不同耐药型的结核分枝杆菌hspX基因序列与表达的比较

杨瑜?王楠?李华?吴玲?王琪?谢贝?刘志辉?孟繁荣

【摘要】目的 比较不同耐药型的结核分枝杆菌（MTB）热休克蛋白基因hspX序列与表达，初步探讨hspX与MTB的耐药是否存在相关性。方法 选取4种一线抗结核药物全部敏感株（S）、同时对异烟肼和利福平耐药（MDR）和一种耐药［单耐利福平（MTBR+）、单耐异烟肼（MTBH+）、单耐链霉素（MTBS+）和单耐乙胺丁醇（MTBE+）］的菌株各10株，采用改良的十二烷基苯磺酸钠裂解法和TRIzol法分别提取各组菌株的DNA和RNA，使用特异性引物进行PCR和实时荧光定量PCR确定hspX基因的存在及其表达。对 PCR 产物进行测序以检查正向和反向的多态性，并用DNAman软件进行与标准株H37Rv序列比对。以敏感菌株（S）组为对照组进行两两对比分析不同耐药型的MTB菌株hspX表达的差异。结果 PCR成功获得各组特异性的hspX基因，與H37Rv序列比对具有97%～99%的同一性，无存在明显差异；以相对定量2-ΔΔCt法计算获得S、MDR、MTBR+、MTBH+、MTBS+和MTBE+菌株hspX的表达分别为0.98（0.89，1.23）、1.49（1.10，2.04）、1.41（0.55，2.80）、1.37（0.68，2.71）、0.91（0.59，1.62）和0.70（0.48，1.18）。

以敏感菌株（S）组为对照组，不同耐药型菌株组与其比较，hspX表达差异均无统计学意义（P均> 0.05）。结论 hspX基因在MTB中是保守的。在自然状态下，hspX基因在MTB的耐药性方面无明显相关性。

【关键词】结核分枝杆菌；热休克蛋白；hspX基因；耐药性

Comparison of hspX gene sequence and expression in Mycobacterium tuberculosis with different drug resistance types Yang Yu， Wang Nan， Li Hua， Wu Ling， Wang Qi， Xie Bei， Liu Zhihui， Meng Fanrong. Institute of Pulmonary Diseases， Guangzhou Chest Hospital， State Key Laboratory of Respiratory Disease， Guangzhou 510095，China

Corresponding author，Meng Fanrong， E-mail： rendong.mfr@163.com

【Abstract】Objective To preliminarily explore whether there is a correlation between heat shock protein gene hspX and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis （MTB） by comparing the sequence and expression of hspX in MTB with different drug resistance types. Methods Ten strains sensitive to all four first-line anti-tuberculosis drugs （S）， one drug resistance （rifampicin-resistant MTBR+， isoniazid-resistant MTBH+， streptomycin-resistant MTBS+ and ethambutol-resistant MTBE+） and multidrug resistance （MDR） to isoniazid and rifampicin were selected， respectively. The DNA and RNA of strains in each group were extracted by modified SDS lysis method and TRIzol method， respectively. The existence and expression of hspX gene were determined by PCR and RT-PCR using specific primers. PCR products were sequenced to check the forward and reverse polymorphism， and DNAman software was employed to compare the sequence with the standard strain H37Rv. The difference in the expression of hspX among MTB strains with different drug resistance types was analyzed by pairwise with the sensitive strain group as the control group. Results The specific hspX gene was successfully obtained by PCR. The hspX gene sequence was 97%-99% identical with H37Rv， and there was no significant difference. The mean expression level of hspX through relative quantitation 2-ΔΔCt in S， MDR， MTBR+， MTBH+， MTBS+ and MTBE+ strains was calculated as 0.98（0.89， 1.23）， 1.49（1.10， 2.04）， 1.41（0.55， 2.80）， 1.37（0.68， 2.71）， 0.91（0.59， 1.62）

and 0.70（0.48， 1.18）， respectively. There was no significant difference in the expression of hspX among different drug-resistant strains groups when the sensitive strain group was regarded as the control group （all P > 0.05）. Conclusion The hspX gene is conserved in MTB. In natural state， there is no significant correlation between hspX gene and drug resistance of MTB.

【Key words】Mycobacterium tuberculosis； Heat shock protein； hspX gene； Drug resistance

目前，一般认为结核分枝杆菌（MTB）对一、二线抗结核药物耐药主要源自药物靶基因的改变，但是目前所发现的基因不能全面解释耐药性，仍有耐药株未测得相应靶基因突变，机制未明［1-2］。抗菌素在许多水平上影响细菌的反应，除了突变引起的获得性耐药性外，应激反应、细胞壁不通透性、外排泵的活性、分枝杆菌酶对抗生素的修饰和基因表达的调节，这些都是有主导蛋白参与的耐药可能机制［3-4］。对于应激调控的热休克蛋白（HSP）可能也影响到MTB的药物敏感性［5］。HSP是一组结构高度保守的蛋白，它普遍存在于细菌、真核生物，属于分子伴侣的超家族，是细胞蛋白质量控制机制的组成部分，被认为是抵御危害细胞蛋白质组的第一道防线［6］。目前还没有明确的研究表明热休克蛋白是否直接或间接地在授予耐药性方面发挥了作用。本研究旨在通过比较不同耐药型MTB的HSP16.3基因hspX序列的表达，初步探讨hspX与MTB的耐药相关性。

材料与方法

一、材 料

1.菌 株

实验所用的MTB菌株均源于我院的MTB菌株库。菌株均已通过生化和分子方法鉴定为结核杆菌以及通过临床药敏诊断实验鉴定为“敏感株（S）”“耐多药（同时对异烟肼和利福平耐药）株（MDR）”“单耐利福平株（MTBR+）”“单耐异烟肼株（MTBH+）”“单耐链霉素株（MTBS+）”和“单耐乙胺丁醇株（MTBE+）”。

2.试剂与仪器

TRIzol（200 mL）、逆转录试剂盒（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits）、荧光定量PCR试剂盒为美国Thermo有限公司产品。Middlebrook 7H9/7H10培养基由美国BD公司生产。细菌超声分散仪BACspreaderTM 1100（体必康）、微量分光光度计（Thermo）、MP快速样品制备仪、荧光定量PCR仪ABI Vin7、凝胶成像系统仪（BioRad）、细菌培养箱等。

二、方 法

1.菌株复苏

-80 ℃冰箱里取出上述各类型的冻存菌各10株，置水浴箱快速解冻，吸取1 mL转接于约7 mL新鲜配置的7H9液体培养基1周，而后取200 ?L菌液涂布于自制的斜面7H10固体培养基，置于37 ℃培养箱2～3周。后续刮取斜面培养物各接种培养3管用于实验研究。

2. DNA提取与鉴定

于斜面固体培养基中刮取湿重约20 mg的菌苔，置于1 mL磷酸盐缓冲液打散重悬，室温以10 000 r/min离心1 min，弃上清，加入600 ?L含有蜗牛酶的反应液，37 ℃水浴过夜。菌壁裂解充分后，按试剂盒的说明步骤依次加样进行，包括去除菌蛋白、洗脱杂质、异丙醇沉淀DNA，最后50 ?L TE缓冲液溶解DNA。取1 ?L DNA样品进行浓度检测。使用针对hspX全基因片段的引物（上游：5′-TCAAAGGCATCCGTTTCCATCG-3′；下游：5′-GGTGGACCGGATCTGAATGTGC-3′）进行PCR扩增，1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行条带鉴定。

3. RNA提取与扩增表达

取各组对数生长期的培养菌液10 mL，调整浓度约为1麦氏浊度，室温以10 000 r/min离心1 min，弃上清，加1 mL TRIzol液体，上下颠倒混匀，全部转移至裂解介质管中，并置于MP快速样品制备仪，快速振荡30 s，冰浴2 min，重復2次。在4℃下以13 000 r/min离心15 min，取上清至RNase-free 1.5 mL EP管，加入200 ?L 氯仿，混匀，室温静置5 min。在4℃下以13 000 r/min离心15 min， 将上层液体转移至另一RNase-free 1.5 mL EP管中，加入600 ?L异丙醇，60 ?L的3 mol/L NaAc （pH 5.3），10 ?L的glogen，-70 ℃条件过夜。在4℃下以13 000 r/min离心15 min， 弃上清，加入1 mL 75% 乙醇重悬，在4 ℃下以13 000 r/min离心5 min，小心去除液滴，自然干燥5 min， 加入40 ?L RNase-free 水溶解。取1 ?L RNA样品进行浓度检测。调整浓度，各样品取10 ?L进行逆转录为cDNA，再使用针对hspX的特异性引物（上游：5′-TTATGGTCCGCGATGGTCAG-3′；下游：5′-AATGCCCTTGTCGTAGGTGG-3′）进行荧光定量PCR扩增，以rrs为内参基因，测得各组菌株hspX的Ct值，并进行相对定量2-ΔΔCt法表达分析，以“敏感菌株（S）”hspX基因表达为“1”标准，超过“1”两倍的为过表达，低于“1” 的1/2为低表达。

4. hspX基因序列测序与比对

以DNA为模板的hspX全基因片段长的PCR产物送至广州华大科技生物有限公司进行正、反向测序，获得的所有序列与NCBI基因库中存在的H37Rv

株的hspX基因（Gene ID：887579）序列进行比较。

三、统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件分析数据。根据各组菌株的hspX基因的Ct值相对表达值（2-ΔΔCt）。正态分布计量数据用表示，两两比较采用两独立样本t检验或校正t检验，多组比较采用单因素方差分析；非正态分布计量数据用中位数（四分位数）即［M（P25，P75）］表示，两两比较采用两独立样本秩和检验，多组比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、hspX全基因片段的鉴定

共提取了60株菌的总DNA，hspX基因全长为435 bp，PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定：条带清晰，无杂带，大小位于500 bp附近。见图1。

二、各组菌株hspX基因序列与标准株H37Rv序列比对

经华大基因测序获得各组菌株hspX基因序列，并与标准株H37Rv基因序列比对，各组序列与标准株H37Rv基因序列无差异，具有97%～99%的同一性。见图2。

三、各组菌株hspX表达差异

经荧光定量PCR检测各组菌株hspX基因与内参基因rrs的Ct值，测得以敏感菌株（S）组为对照的相对表达值（2-ΔΔCt）。不同耐药型MTB各组菌株hspX基因的表达差异无统计学意义（F = 1.830，P = 0.122）。见表1

讨论

近年来，HSP功能和特性的复杂性和多样性以及它们对人类疾病的影响受到广泛关注。在细菌中，HSP不仅能保护细胞免受非生物威胁，充当分子伴侣，还参与细菌多种生物功能，增强细菌自身毒力，是细菌抵御非生物威胁的重要蛋白［7］。HSP在药物抵抗方面也是研究热点。白色念珠菌HSP90蛋白协调细胞壁的补偿修复机制，响应抗真菌引起的应激，参与了抗真菌耐药性的快速发展［8-9］。Zhou等［10］通过转录组学比较敏感与耐药的白色念珠菌，发现多个HSP相关基因（HSP12和HSP90）在抗耐药菌株中表达上调。在MTB中，HSP70是一种 ATP 依赖性分子伴侣蛋白，针对HSP70的变构抑制剂能够提高氨基糖苷类抗菌药物的疗效并降低对一线结核病药物利福平的耐药性［11］。

在MTB被巨噬细胞吞噬后，HSP16.3暴露于应激（低氧）压力下，由两个传感器激酶（如DOSS和DOST）组成的双组分系统被激活，调节剂DOSR磷酸化，HSP16.3表达上调［12］。与其他HSP一样，HSP16.3是MTB重要生存毒力蛋白，低氧休眠时其高表达，抑制巨噬细胞功能以至于MTB在细胞内存活，同时细胞壁增厚，是抗结核药物抵抗的可能通路［13］。Hu等［14］用hspX缺失突变菌株（ΔhspX株）与野生菌株感染正常的BALB/C小鼠3周后，给予利福平、异烟肼和吡嗪酰胺治疗14周，通过器官细菌计数，发现感染ΔhspX株的小鼠进行抗菌药物治疗后，体内细菌清除更快，提示hspX基因缺失，可能提高了体内细菌的药物敏感性。

因此，本研究初步通过比较不同耐药型的MTB hspX序列与表达，初步探讨hspX与MTB的耐药相关性，实验结果表明hspX基因序列在所有结核分离株中均较为保守，在各类型临床分离耐药MTB中发现无明显差异，与Seyed Majidi等［15］的研究结果一致。本研究结果还显示单耐利福平和单耐异烟肼的菌株组hspX表达比敏感组高接近2倍，利福平和异烟肼耐药可能跟hspX有关，尽管统计学分析表明不同耐药型菌株与敏感株的hspX的表达量比较无明显差异，然而该基因在药物刺激下的表达情况未知，这也是我们后续实验中重点的内容，我们将进行不同培养时间不同抗结核药物刺激下MTB hspX的表达情况，同时还探讨标准株H37Rv在不同抗结核药物诱导的作用下为耐药株的过程中hspX的表达。相似工作也有同行在进行，Nachappa等［16］通过研究暴露于抗结核药物HSP-DnaK/ClpB分子伴侣网络中选择基因的表达，以评估它们在异烟肼和利福平暴露期间MTB临床分离株的应激反应中的作用，但实验结果因样本量不足未能充分验证。

总之，HSP维持细胞蛋白功能方面至关重要，它们在抗结核药物引起宿主细胞的应激压力的影响尚不清楚。关于MTB的HSP对抗结核药物的适应性反应的研究将有助于我们更好地了解抗结核药物的作用机制和耐药性。这些知识可以为治疗MTB提供新的靶点，并用于开发新药或增强剂，以提高现有的抗结核药物的敏感性。

参 考 文 献

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（收稿日期：2022-12-25）

（本文編辑：杨江瑜）