不同剂量UVA1光疗对免疫接触性致敏小鼠皮肤光损伤的影响

邓蕙妍?田歆?李华平?陈教全?朱慧兰

【摘要】目的 探讨不同剂量长波紫外线1（UVA1）照射对皮肤造成的损伤程度，平衡UVA1光疗作用与光损伤的关系，以期获得治疗的最大效益。方法 模拟不同剂量UVA1照射治疗免疫接触性致敏小鼠模型，观察治疗过程中皮肤的光损伤程度并对光损伤相关指标进行检测。结果 随着剂量和照射次数的增加，皮肤出现黑斑的小鼠比例高于无晒伤表现或红斑的小鼠（P < 0.05），但皮肤厚度和组织形态学与未照光免疫接触性致敏小鼠模型组相比均无明显改变。皮肤丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）检测显示，随着照射剂量和照射次数的增加，小鼠皮肤MDA含量也随之升高（P < 0.05）；对GSH而言，随着照射剂量的增大，小鼠皮肤GSH含量下降（P < 0.05）；不同的照射次数对小鼠皮肤GSH含量无明显影响。结论 不同剂量的UVA1光疗均可造成皮肤光损伤，并随着剂量和次数的增加而损伤加重。但短期内这种光损伤是轻微的，尤其是低剂量UVA1照射，中高剂量UVA1照射则需考虑光疗作用与光损伤的平衡。

【关键词】长波紫外线1；光疗；光损伤；丙二醛；还原型谷胱甘肽

Effect of different doses of UVA1 phototherapy on skin photodamage in immune-contact sensitized mice Deng Huiyan，Tian Xin， Li Huaping， Chen Jiaoquan， Zhu Huilan. Department of Dermatology， Guangzhou Institute of Dermatology， Guangzhou  510095，China

Corresponding author， Zhu Huilan， E-mail： zhlhuilan@126.com

【Abstract】Objective To evaluate the degree of skin injury caused by different doses of UVA1 irradiation and balance the relationship between UVA1 phototherapy and photodamage， aiming to maximize the therapeutic benefits. Methods Different doses of UVA1 irradiation were simulated to treat immune-contact sensitized mouse models. The degree of skin photodamage during treatment was observed and photodamage-related indexes were detected. Results With the increase of dose and irradiation times， the proportion of mice with black spots on the skin was significantly higher than that of mice without sunburn or erythema （both P < 0.05）. However， there were no significant changes in skin thickness and histomorphology compared with the non-photosensitized mouse model group. The detection of malondialdehyde （MDA） and reduced glutathione （GSH） on the skin showed that the increase of doses and irradiation times would cause the increase of MDA content （P < 0.05）； For GSH， the increase of doses would cause the decrease of GSH content （P < 0.05）；and the irradiation time exerted no effect （P > 0.05）. Conclusions Different doses of UVA1 phototherapy can cause skin photodamage， which is aggravated with the increase of dose and frequency. However， this photodamage is mild in the short term， especially with low-dose UVA1 irradiation. The balance between phototherapy effect and photodamage needs to be considered for moderate- and high-dose UVA1 irradiation.

【Key words】UVA1； Phototherapy； Photodamage；Malondialdehyde；Glutathione

长波紫外线（UVA）分为UVA1（340～400 nm）

和UVA2（320～340 nm），其中UVA2物理和生物學效应与中波紫外线（UVB，280～320 nm）相近。UVA1能够穿透真皮乳头层进入皮下组织浅层。与UVB相比，由于波长增加，UVA1的穿透深度增加。根据其波长，UVA1的靶向位置正好是皮肤深层的细胞，包括成纤维细胞、肥大细胞、淋巴细胞和树突状细胞等［1］。其物理特性决定了UVA1对炎症性皮肤病治疗有效。目前UVA1在临床上用于银屑病、局限性硬皮病、特应性皮炎、色素性荨麻疹等多种免疫相关性皮肤病，疗效肯定，但治疗剂量并无统一的标准。UVA1治疗剂量分为3个等级：10～29 J/cm2为低剂量，30～59 J/cm2为中剂量，60～120 J/cm2为高剂量［1］。

UVA1光疗由于穿透较深，在治疗的同时可以引起皮肤日晒伤和光老化反应，出现红斑、水肿等急性光损伤表现和皮肤萎缩、色素异常等慢性光损伤表现。为探讨不同剂量UVA1照射对皮肤造成的损伤程度，避免在治疗过程中由于光热效应，导致皮肤在原有疾病的基础上损伤加重，本研究模拟不同剂量UVA1照射治疗免疫接触性致敏小鼠模型，观察了治疗过程中皮肤的光损伤程度并对光损伤相关指标进行检测。

材料与方法

一、材 料

BALB/c雄性小鼠63只，6～8月龄，体重20～30 g，购买自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（粤）2022-0298。UVA1光疗仪，LED光源，波长366.42 nm，购自徐州市科诺医学仪器设备有限公司。丙二醛（MDA）测定试剂盒，购自南京建成科技有限公司。微量还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒，购自南京建成科技有限公司。正置白光拍照显微镜，日本Nikon，型号Eclipse Ci-L。测量分析软件，美国Media Cybemetics，型号Image-Pro Plus 6.0。

二、方 法

1.实验分组

60只BALB/c雄性小鼠，编号后使用随机数字表进行分组，共4组，分别为模型组（15只）、UVA1低剂量照射组（15只）、UVA1中剂量照射组（15只）和UVA1高剂量照射组（15只），另设空白阴性对照小鼠3只（空白对照组）。模拟临床治疗方案对小鼠进行UVA1光疗。模型组：建立免疫接触性致敏小鼠模型；UVA1低剂量照射组：30 J/cm2 UVA1对免疫接触性致敏小鼠模型进行照射，每周2次；UVA1中剂量照射组：60 J/cm2 UVA1对免疫接触性致敏小鼠模型进行照射，每周2次；UVA1高剂量照射组：80 J/cm2 UVA1对免疫接触性致敏小鼠模型进行照射，每周2次。每次照射光源与小鼠的垂直照射距离为15 cm。空白对照组只对小鼠进行背部去毛拍照，未进行其他处理。本实验符合动物实验相关伦理规范（IACUC-G16014）。

2.免疫接触性致敏小鼠模型的构建

小鼠预先背部去毛3 cm×4 cm，小鼠尾静脉注射浓度0.5 mg/mL的抗DNP IgE单克隆抗体，给药剂量2 μg/只，注射体积200 μL/只。24 h后在小鼠双耳各涂0.15% 2，4-二硝基氟苯（DNFB）进行激发，每天1次连续激发。观察连续出现风团3 d后开始进行UVA1照射，每周2次，疗程为8周。期间正常饮食。

3.标本采集及保存

处死小鼠后，切下背部的皮肤组织，一部分用4%甲醛液固定，一部分用生理盐水冲洗，液氮速冻后转入-70℃超低温冰箱保存。

4.指标检测

4.1 晒伤程度

观察各组小鼠的晒伤程度并评分，1分为无晒伤；2分为出现红斑；3分为出现黑斑；4分为出现水疱。

4.2 皮肤厚度

对各组小鼠分别于照射的1周、2周、4周、6周和8周进行皮肤厚度的测量。送检样本经4%多聚甲醛固定，固定状态良好后，严格按照本單位病理实验检查SOP程序进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片最后镜检合格的样片。使用Eclipse Ci-L拍照显微镜选取组织的目的区域进行40倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。使用Image-Pro Plus 6.0分析软件，统一以mm作为标准单位，测量每张切片中的5处皮肤厚度，并计算出平均值。

4.3 MDA检测

对各组小鼠分别于照射的1周、2周、4周、6周和8周进行皮肤MDA含量的检测。样品与试剂混合，盖上盖，旋涡混匀器混匀，95℃以上水浴40 min，取出后流水冷却，4000 r/min离心10 min，530 nm，将酶标板空板进行扫描，准确吸取0.25 mL各管反应液加入到新的96孔板中，酶标仪测定各孔吸光度，根据公式计算MDA含量。

4.4 还原型GSH检测

对各组小鼠分别于照射的1周、2周、4周、6周和8周进行皮肤GSH含量的检测。样品与试剂混合，静置 5 min，405 nm 处，酶标仪测定各孔吸光度值，根据公式计算GSH含量。

三、统计学处理

运用R 4.1.3 软件进行统计学分析。采用 Shapiro-Wilk 检验进行正态性检验、 Leven 法进行方差齐性检验。正态分布计量资料以表示，非正态分布资料以中位数（四分位间距）表示。采用广义线性模型分析光疗剂量及照射次数和小鼠晒伤情况的关系；采用双因素方差分析UVA1 光疗剂量对不同组别小鼠皮肤厚度、皮肤MDA含量和皮肤GSH含量的影响，组间比较采用Bonferroni检验；P < 0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、UVA1光疗对小鼠皮肤晒伤程度的影响

连续记录小鼠每次UVA1光疗后第二日的皮肤晒伤情况，共16次。结果显示在控制了剂量分组以后，随着照射次数增加，出现晒伤的可能性更大（Z = 2.596，P < 0.05，见图1、2）。全部小鼠均未观察到水疱的出现。

二、UVA1光疗对小鼠皮肤厚度和组织结构的影响

不同剂量UVA1照射和不同照射次数之间的交互作用无统计学意义（F = 1.185，P > 0.05），即不同剂量UVA1照射和不同照射次数的交互作用对小鼠皮肤厚度没有明显影响；不同剂量UVA1照射的主效应检验结果为F = 2.572，P > 0.05，表明不同剂量UVA1照射时，小鼠皮肤厚度差异无统计学意义；不同照射次数的主效应检验结果为F = 0.528，P > 0.05，表明不同的照射次数对小鼠皮肤厚度无明显影响，见图3；第8周结束照射时，不同剂量照射组皮肤组织形态学无明显异常，见图4。

三、UVA1光療对小鼠皮肤MDA含量的影响

不同剂量UVA1照射和照射次数存在交互作用（F = 15.990，P < 0.05），因此分析单独效应，同一剂量UVA1照射情况下，随着照射次数的增加，小鼠的皮肤MDA含量也不断增加，差异有统计学意义；在同样照射次数的条件下，UVA1高剂量照射组小鼠皮肤MDA含量高于中UVA1低剂量照射组，差异有统计学意义（F = 6.287， P < 0.05）。见图5。

四、UVA1光疗对小鼠皮肤GSH含量的影响

不同剂量UVA1照射和不同照射次数之间的交互作用无统计学意义（F = 0.968，P > 0.05），即不同剂量UVA1照射和不同照射次数的交互作用对小鼠皮肤GSH含量没有明显影响；不同剂量UVA1照射的主效应检验结果为F = 35.609，P < 0.05，表明在同样照射次数情况下，不同剂量UVA1照射对小鼠皮肤GSH有明显影响，且随着照射剂量的增大，GSH含量下降。不同照射次数的主效应检验结果为F = 3.132， P > 0.05，表明不同的照射次数对小鼠皮肤GSH含量无影响。见图6。

讨论

光疗是多种病因皮肤病的一线治疗手段，目前研究表明其治疗机制涉及DNA损伤导致的环丁烷嘧啶二聚体形成、活性氧产生、顺式-反式尿烷酸异构化、维生素D合成、血小板活化因子分泌和炎症小体激活等［2-7］。根据其作用机制可知，光疗的治疗作用是双刃剑，治疗的同时可能会造成皮肤组织的光损伤。

UVA在皮肤中产生活性氧，导致细胞和细胞外基质的光氧化损伤。脂质过氧化作用（LPO）导致细胞膜连续损伤和随后的信号通路严重紊乱，是光氧化应激促进皮肤老化和皮肤癌生成的途径之一。MDA是脂质降解的主要终产物，代表了LPO的公认参数［8］。

皮肤拥有一个复杂的、部分可诱导的抗氧化网络来防御光氧化应激，抗氧化剂网络包括低分子自由基清除剂，如谷胱甘肽、维生素C、维生素 E 以及协调的细胞内酶途径。该酶促途径由超氧化物歧化酶 （SOD） 组成，SOD催化毒性超氧阴离子 （O2） 向过氧化氢 （H2O2） 的转变。这些酶有两种亚型，位于线粒体的锰-SOD 和位于胞质的铜-锌-SOD。由活性 SOD 和其他途径产生的 H2O2 分子被摄取，并通过谷胱甘肽过氧化物酶 （GPX） 或过氧化氢酶进一步加工成分子 O2 和水。GPX 还以相同的方式解毒脂质氢过氧化物，因此对于通过脂质过氧化特异性预防膜损伤具有特别重要的意义［9-10］。Schneider等检测UVA1与皮肤成纤维细胞的抗氧化防御系统时证实，抗氧化皮肤保护系统对活性氧，虽然能够适应重复的UVA暴露，但处于脆弱的平衡。它提供的保护量可能因个人而异。决定这种变异的确切因素尚待详细研究，然而，似乎该机制对GSH耗竭非常敏感［8］。由上可知，UVA1的光损伤程度与MDA和GSH水平密切相关。除此以外，紫外线照射除了急性光损伤以外，还会导致光老化，引起皮肤厚度增加，组织结构发生紊乱。

紫外线对皮肤的急慢性光损伤除了与波长有关，也与剂量密切相关。与此相对，光疗的效果也与剂量联系紧密。对白癜风、硬皮病、特应性皮炎等疾病的临床研究或回顾性分析发现低、中、高剂量的UVA1治疗均对疾病有效，但不同疾病某个等级的剂量效果可能更佳［11-13］。

UVA1由于波长较长，对表皮全层和真皮浅层均有影响，曾有学者对人工皮肤进行不同剂量UVA1照射，发现UVA1剂量达到40 J/cm2时，真皮浅层的成纤维细胞活性下降，皮肤发生光损伤［14］。由此可知，如何平衡不同剂量的治疗和光损伤的关系对临床应用有极大影响。既往未见利用活体病理模型进行UVA1光疗后皮肤光损伤的观察研究，本实验引入免疫性接触性致敏小鼠模型，模拟人体在致敏状态下接受不同剂量UVA1治疗，观察其光损伤的程度。本实验结果显示，UVA1每周2次，照射8周的疗程，随着照射剂量和次数的增加，皮肤红斑和黑斑出现的频率增高，但低、中、高剂量UVA1照射均没有引起小鼠皮肤厚度的改变，对皮肤组织结构亦无明显影响。表明不同剂量UVA1光疗8周的疗程不会导致皮肤组织形态学的改变。MDA和GSH的结果提示，低剂量UVA1照射在早期对皮肤MDA的含量无明显影响，但照光次数增多后也会引起MDA含量增加，而中、高剂量的UVA1在照射早期就能引起MDA含量增加；对GSH而言，不同的照射次数对小鼠皮肤GSH含量无明显影响。

综上所述，不同剂量的UVA1光疗均可造成小鼠皮肤光损伤，并随着剂量和次数的增加而损伤加重。但8周的光疗并未引起皮肤组织形态学的改变，由此可认为，这种损伤是相对轻微的，尤其是低剂量UVA1光疗。因此在临床实际治疗时，当短期应用低剂量UVA1光疗时，可忽略其对皮肤的光损伤作用，当需要中、高剂量UVA1进行光疗，特别是治疗时间较长，照射次数较多时，需考虑治疗效果与光损伤作用的平衡，以期取得最大获益。

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（收稿日期：2022-12-25）

（本文編辑：杨江瑜）