喀斯特山地生态养鸡对土壤理化性质及菌群结构的影响

木仁 王鑫 格根图雅 马媛 冉田田 陈志 徐文斌 李静

关键词：喀斯特山地：生态养鸡：土壤理化性质；土壤细菌：土壤真菌

蛋鸡山地生态养殖条件下，因食物来源广泛，补饲量减少，可达到一定节约饲料的效果，并可有效提高肉蛋品质。借助山地生态环境的立体复合生产经营，可提高土地利用效率，对企业／合作社和农户的增收具有重要意义。因此，山地生态养殖已成为家禽行业的重要发展方向。有研究发现，香榧林下养鹅可改变土壤细菌、真菌群落结构，提高微生物多样性；柑橘林下养鸡可有效提高土壤养分含量，改善果品品质：但桑园种草养鸡可导致土壤出现酸化趋势．枣园林下长期养鸡会破坏土壤物理性质。前人研究结果存在较大差异，主要与不同种养结合模式、地理环境及养殖条件等综合因素有关。因此，有必要对不同区域、不同养殖条件下的土壤进行综合评价，探索其变化规律，为生态养殖提供基础情报。基于此，本研究以喀斯特山地生态养鸡场为研究对象，分别对养殖区、轮休区和未养殖区的土壤理化性质及菌群组成进行综合评价，以期为喀斯特山地生态养鸡提供参考。

1材料与方法

1.1试验地概况

试验地位于贵州省长顺县鼓扬镇某长顺绿壳蛋鸡山地生态养殖基地。该区域属亚热带季风气候，气候温和、雨量充沛、阴雨天气较多，年平均气温16℃，年平均降水量1260mm。

1.2试验设计

在同一地域，以山地放养为影响因素，分别设置养殖区（CA组：连续放养3个月的区域，养殖密度为每666.7m260只）、轮休区（RA组：连续3个月未放养区域）和未养殖区（NCA组：从未放养的区域）。每个区域面积约666.7m2，于2020年7月11日按五点取样法采集0～20cm土层鲜土样，每区域5份，共15份。

1.3土壤理化性质测定

参考陶彩蝶、盛茂银等的试验方法，采用环刀法测定容重；含水率测定采用烘干法（GB/7172-1987）；酸碱度用pH计（PHS-3C）测定；全氮含量测定采用凯氏定氮法（LY/T 1228-2015）；全磷和全钾含量的测定采用碱熔法（LY/T1232-2015和LY/T 1234-2015）。

1.4土壤菌群结构测定

利用Magen Hipure Soil DNA Kit提取土壤总DNA，使用Equalbit dsDNA HS Assay Kit检测DNA浓度。参考木仁等的方法对细菌16SrRNA V3-V4区进行扩增，引物为F：5'-CCTACG-GRRBGCASCAGKVRVGAAT-3和R：5'-GGACT-ACNVGGGTWTCTAATCC-3。参考王灿等的方法对真菌ITS2区进行扩增，引物为F：5 7-GT-GAATCATCGARTC-3禾口R：5 7-TCCTCCGCTTAT-TGAT-3'。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。通过酶标仪（ Tecan，Mannedorf，Switzerland）检测文库浓度后，按Illumina MiSeq（ Illumina，SanDiego，CA，USA）仪器使用说明书进行双端测序。測序工作由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

1.5数据处理与分析

参照相关文献对数据进行整理，在97%相似水平下对所有序列进行OTU（operationaltaxonomic units）划分，并进行生物信息统计分析，得到OTU代表序列。代表序列与Silva 132和U—NITE ITS数据库进行比对，得到OTU对应的物种分类信息。基于Qiime 1.g.1计算Alpha多样性指数。将土壤理化性质、Alpha多样性及菌群丰度数据导人SPSS 23.0软件，满足正态分布和方差齐性检验条件的数据运用单因素方差分析中的LSD法进行多重比较，不满足正态分布条件的采用非参数检验中的Kruskal-Wallis法，结果均以平均值±标准差表示。基于Canoco5对土壤理化性质和菌群结构进行冗余分析（RDA）。采用Pearson相关分析探究土壤理化性质与菌群丰度间的关系。

2结果与分析

2.1不同处理土壤理化性质比较

由图1可知，土壤pH值从高到低的顺序为NCA>RA >CA，处理间差异极显著。含水率从高到低的顺序为NCA>CA>RA，NCA与CA间差异显著，与RA间差异极显著。容重从高到低的顺序为RA>CA>NCA．RA与CA和NCA间差异极显著。全氮含量不同处理间差异不显著。全磷含量从高到低的顺序为CA >RA >NCA，CA与NCA间差异显著。全钾含量从高到低的顺序为CA>RA>NCA，CA与RA间差异显著，与NCA间差异极显著。

2.2不同区域土壤菌群测序结果

由表1可知，CA、RA和NCA组细菌的原始序列在53303条以上，有效序列50167条以上，平均序列长度分别为451、455、454 bp，OTU数在5952个以上。CA、RA和NCA组真菌的原始序列43709条以上，有效序列数34706条以上，平均序列长度分别为338、349、350bp，OTU数在270个以上。

由图2A可见，三组共有细菌OTU 4141个，CA组特有3113个，RA组特有5 497个，NCA组特有7637个。三组共有真菌OTU224个，CA组特有55个，RA组特有112个，NCA组特有99个（图2B）。

2.3不同区域土壤菌群Alpha多样性分析

如表2所示，土壤细菌Alpha多样性分析发现，RA组的Ace指数和Chaol指数最高，显著高于CA组。RA和NCA的Shannon和Simpson指数极显著高于CA组。真菌Alpha多样性分析发现，RA组的Ace指数显著高于CA组，极显著高于NCA组，CA组显著高于NCA组。RA组的Chaol指数极显著高于NCA组．CA组的Chaol指数显著高于NCA组。Shannon指数和Simpson指数各处理差异不显著。

2.4不同区域土壤门水平上细菌和真菌相对丰度

共注释到46个门的细菌，相对丰度高于1%的有12个。如表3所示，变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门为各组优势菌门。与CA组相比，RA和NCA组的变形菌门、拟杆菌门、Latescibacteria和Rokubacteria的相对丰度增加，其中NCA组的变形菌门、拟杆菌门和Latescibacteria显著或极显著增加。与CA组相比，RA和NCA组的酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、厚壁菌门和Patescibacteria的相对丰度降低，其中NCA组的酸杆菌门、硝化螺旋菌门和厚壁菌门显著或极显著降低。NCA组的绿弯菌门极显著高于CA和RA组．NCA组的疣微菌门极显著低于RA组。

本研究共注释到12个门的真菌，相对丰度高于1%的有6个。如表4所示，子囊菌门、担子菌门和毛霉门为各组优势菌门，并存在大量未知真核生物（k_Eukaryota_ Unclassified）。与CA组相比，RA组的毛霉门极显著增加，NCA组的毛霉门显著降低。

2.5不同区域土壤理化性质与茵群群落结构间的关系

土壤理化性质与主要细菌群落结构的RDA分析（图3）表明，第一、第二轴的解释率分别为47.32%和25.12%，土壤pH值、全氮含量分别极显著、显著影响细菌群落结构。pH值与拟杆菌门呈极显著正相关，与变形菌门和Latescibacteria呈显著正相关，与酸杆菌门和厚壁菌门呈极显著负相关，与放线菌门呈显著负相关。全氮含量与疣微菌门呈极显著正相关，与硝化螺旋菌门呈显著正相关，与绿弯菌门呈极显著负相关。

土壤理化性质与主要真菌群落结构的RDA分析（图4）表明，第一、第二轴的解释率分别为38.32%和24.10%．全钾含量和容重显著影响真菌群落结构。全钾含量与子囊菌门呈极显著正相关，与k—Eukaryota—Unclassified呈显著负相关。容重与毛霉门和壶菌门呈显著正相关。

3讨论与结论

土壤pH值、氮、磷和钾等土壤物理及养分特性是评价土壤系统质量的重要指标。王介平等研究发现，桑园种草养鸡后土壤出现酸化趋势，并认为这一趋势与鸡粪中有机质被土壤中微生物分解成有机酸等因素有关。陶彩蝶研究发现，在香榧林下养鹅导致土壤容重增高、含水率降低，并认为该现象与鹅长时间踩踏及植被减少而导致的土壤板结、渗透性弱有关。周乃富等研究发现，油茶林下养鸡使土壤中钾和磷的含量增加。以上结果与本研究的养殖区（CA）pH降低、容重增加、含水率降低及钾、磷含量增高的结果相近。表明喀斯特山地长期连续养鸡可造成土壤酸化、持水力减弱，钾、磷含量增加。

细菌是土壤微生物中的最大类群，也是评价土壤健康与否的重要微生物指标之一。Chaol指数和Ace指数用来度量菌群丰富度，Shannon指数和Simpson指数可以反映物种多样性。王永宏等研究发现，短期牦牛重度放牧可导致土壤细菌Alpha多样性呈减少趋势。臧晓琳等研究发现，重度放牧条件下，冷蒿根际土壤微生物群落Shannon指数和Simpson指数极显著降低（P<0.01）。本研究发现，养殖区细菌Alpha多样性指数最低，并且相对于未养殖区（NCA），Shannon指数和Simpson指数极显著降低，与前人研究结果相近。轮休区（RA） Alpha多样性指数最高。表明喀斯特山地长期连续养鸡可造成细菌丰富度和多样性降低，但轮休后可得到良好恢复。

真菌是土壤中非常活跃的一类微生物群体，具有多种功能，包含有機质的降解等，与土壤健康密切相关。黄维等研究发现，随着放牧强度的增加，荒漠草原非植物根际土壤中可培养真菌的总量呈下降趋势，尤其是表层（0～10cm）土壤中的真菌数量。杨晶晶等研究发现，重度放牧导致伊犁绢蒿荒漠草地土壤真菌Chaol指数显著降低（P<0.05），Shannon指数无显著变化。但陶彩蝶研究发现，香榧林下养鹅导致鹅活动区土壤真菌Chaol、Ace及Shannon指数增加，但不显著（P>0.05）。本研究发现，养殖区和轮休区（RA） Chaol指数和Ace指数显著或极显著高于未养殖区，与前人研究结果具有一定差异。指数变化表明，喀斯特山地养鸡可导致土壤真菌丰富度明显增加，但物种多样性有所降低（Shannon指数最低）。轮休后真菌丰富度增加，物种多样性也得到一定恢复（Shannon指数最高）。

本研究发现，土壤细菌的优势菌门为变形菌门（36.452%～42.378%）、酸杆菌门（23.362%～31.836%）和拟杆菌门（4.710%～11.488%）。相对于未养殖区，养殖区的变形菌门和拟杆菌门显著或极显著降低，酸杆菌门极显著增加。相关研究表明，荒漠草原放牧后土壤变形菌门丰度降低；高寒草地放牧区变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门均表现出降低趋势，但无显著差异（P>0.05）：香榧林下养鹅导致鹅活动区酸杆菌门丰度显著下降（P<0.05）。以上研究的变形菌门和拟杆菌门变化趋势与本研究相近，但酸杆菌门相对丰度变化与本研究有较大差异，具体原因需进一步探索。

本研究土壤优势真菌为子囊菌门（17.453%～31.368%）、担子菌门（13.295%～19.737%）和毛霉门（7.253%～21.492%），并存在大量未知真核生物（k_Eukaryota—Unclassified，36.706%～52.867%）.大量研究表明，土壤优势真菌为子囊菌门和担子菌门，与本研究结果相近，但不同区域优势菌门丰度具有较大差异。本研究发现，相对于未养殖区，养殖区和轮休区的子囊菌门和毛霉门表现出增加趋势，担子菌门和k_Eukaryota_Unclassified表现出下降趋势。前人研究发现，荒漠草原放牧后土壤子囊菌门的相对丰度降低，担子菌门的相对丰度升高。香榧林下养鹅、稻田养鸭后土壤子囊菌门丰度显著下降（P<0.05），与本研究结果相比具有较大差异。土壤真菌群落组成除受地表植被、地理环境和土壤类型等因素影响外，还可能受到放养动物类别的影响，因此，土壤真菌丰度的差异性需从多种因素综合考虑。

土壤为微生物的生存提供了环境条件，并认为土壤pH值和容重及水分、氮、磷和钾含量是影响土壤菌群结构的重要因子。本研究RDA分析发现，土壤pH值、全氮含量分别极显著、显著影响细菌群落结构。土壤pH值与6种细菌菌门丰度、全氮与3种细菌菌门丰度呈显著或极显著相关性。表明土壤pH值和全氮含量为细菌群落结构的主要影响因素。土壤全钾和容重显著影响真菌群落结构，与细菌群落结构的主要影响因素具有一定差异．这可能与以上菌群的功能特性及环境互作机制有关。

综上所述，喀斯特山地长期连续养鸡可导致土壤酸化、持水力减弱及钾、磷含量的增加；并造成细菌丰富度和多样性及真菌多样性的减少，而且对菌群结构具有较大影响。轮休后以上情况得到较好改善。因此，在山地生态养殖中，应避免同一地点连续养殖，并制定科学合理的轮休机制。