强筋小麦贮藏蛋白的积累动态、种类及相对含量分析

房春豪 韩冉 毛凤鑫 汪晓璐 徐文竞 王开 祁广 曹新有 李豪圣 刘爱峰 刘成

关键词：强筋小麦；中筋小麦；麦谷蛋白；醇溶蛋白；谷蛋白大聚合体（GMP）

小麦籽粒主要由淀粉、脂类和蛋白质等物质组成。根据蛋白质组分在不同溶剂中的溶解性，将小麦籽粒蛋白分为溶于水的清蛋白、溶于稀盐的球蛋白、溶于70%乙醇的醇溶蛋白和溶于稀酸或稀碱的麦谷蛋白。麦谷蛋白是一种非均质的大分子聚合体，是由多个亚基通过分子间二硫键相互交联形成的多聚体，按其在SDS-PAGE中的迁移率，又分为高分子量麦谷蛋白（HMW-GS）和低分子量麦谷蛋白（LMW-GS）。谷蛋白聚合体主要由HMW-GS和LMW-GS通过链间二硫键链接而成，其在非解离状态下，由一系列分子量大小不同的聚合体组成。谷蛋白聚合体中，不溶于SDS的谷蛋白聚合体分子量较大，稱之为谷蛋白大聚合体（GMP），其含量反映了谷蛋白聚合体的粒度分布。研究发现谷蛋白大聚合体含量越高，面筋的强度和弹性越大。

小麦面粉生产及产品加工质量的高低与籽粒蛋白质含量及其数量密切相关。其中，醇溶蛋白和麦谷蛋白的组成、含量和比例影响着小麦面筋的品质。麦谷蛋白决定面筋的弹性，醇溶蛋白决定面筋的黏性和延展性。麦谷蛋白和醇溶蛋白共同形成面筋并以一定的比例结合时，才共同赋予面团特有的性质。不同小麦品种麦谷蛋白和醇溶蛋白的含量和比例不同，从而导致面团弹性和延展性的差异。近几年发现一种半胱氨酸残基含量高冗余的新型小麦籽粒蛋白Avenin-like蛋白，该类蛋白以其富含半胱氨酸（cys）残基之特性被广泛关注。由于半胱氨酸（cys）是形成蛋白质二硫键的基础，其位置及数量影响二硫键的形成。因此，对Avenin-like蛋白的深入研究将对分子水平小麦品质改良具有重要意义。

济麦229、济麦44和济麦22为山东省农业科学院作物研究所育成的小麦品种，其中济麦229和济麦44为优质强筋小麦，其高分子量麦谷蛋白亚基组合均为（1，7+8，5+10），在首届黄淮麦区优质小麦鉴评会上均被评为超强筋小麦品种（全国仅4个）。济麦22为高产、广适、中筋小麦品种，其高分子量麦谷蛋白亚基组合为（7+8，4+12）。本研究以这3个小麦品种为试材，分析其籽粒发育期谷蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白聚合体的形成规律，确定影响小麦面筋品质性状形成的关键时期，了解品质性状形成的分子机制，并通过TMT蛋白组学分析3个小麦品种成熟籽粒贮藏蛋白的量及优质强筋小麦中贮藏蛋白的差异，为我国小麦品质改良和优质小麦生产提供技术参考。

1材料与方法

1.1试验材料

供试优质强筋小麦品种济麦229、济麦44以及高产、中筋小麦品种济麦22，由山东省农业科学院作物研究所小麦遗传育种团队育成并提供，于2018-2019年种植在山东省农业科学院作物研究所小麦育种试验基地（济南）。于小麦开花期挂牌标记开花一致的单穗200个，花后每5天取标记穗20个，取籽粒晾晒，保存备用。籽粒磨制采用FOSS旋风式磨。

1.2测定指标及方法

1.2.1蛋白含量测定利用丹麦福斯1241公司生产的近红外谷物分析仪测定。

1.2.2籽粒GMP含量测定

称取250mg面粉置于50 mL离心管中，加入0.5%（W/V） SDS-0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.9） 23 mL，涡旋振荡20s，至完全分散，再用恒温混匀仪30℃下以1000r/min搅拌5min，恒重后以11600×g离心力、30℃离心30min，弃上清液，所剩沉淀于115℃烘至绝干后称重。烘干后的沉淀用MM400冷冻研磨仪研磨，采用杜马斯定氮仪测定籽粒GMP含量。

1.2.3醇溶蛋白和麦谷蛋白的提取及含量测定

醇溶蛋白和麦谷蛋白的提取参考杨学举的方法。取0.1g面粉样品置人离心管中，加70%乙醇10mL，充分搅拌后振荡20min，4000r/min离心5min，取上清，同样方法共连续提取3次后合并上清液转入50mL容量瓶中定容，待测醇溶蛋白。麦谷蛋白用0.5%KOH提取，方法过程与提取醇溶蛋白相同。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。

1.2.4成熟籽粒不同类型贮藏蛋白量的测定3个品种成熟籽粒贮藏蛋白量的测定采用TMT蛋白测定技术．由杭州景杰生物科技股份有限公司完成。

1.3数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010处理数据和作图。

2结果与分析

2.1强筋小麦籽粒醇溶蛋白的积累动态

对3个小麦品种醇溶蛋白的含量进行分析（图1）发现，籽粒发育过程中其醇溶蛋白的积累动态均呈持续上升的变化趋势。花后5～15天，随灌浆时间推进，籽粒醇溶蛋白含量增速较快，花后15～25天增速稍平缓，花后25～35天增速又加快。总体来看，整个籽粒灌浆期，强筋小麦济麦44和济麦229的醇溶蛋白含量均高于中筋小麦济麦22。从高分子量麦谷蛋白亚基类型上看，整个籽粒灌浆期，5+10亚基组合的醇溶蛋白含量均高于4+12亚基组合。

2.2强筋小麦籽粒麦谷蛋白的积累动态

对3个小麦品种麦谷蛋白的含量进行分析（图2）发现，籽粒发育过程中麦谷蛋白的积累动态呈上升趋势，花后5～10天，济麦44的麦谷蛋白含量增速较快，花后10～35天增速稍下降，但麦谷蛋白含量持续增长。花后5～20天，济麦229的麦谷蛋白含量增速较20～35天的增速低。总体来看，整个籽粒发育时期，强筋小麦济麦44和济麦229的麦谷蛋白含量始终高于中筋小麦济麦22。从高分子量麦谷蛋白亚基组成类型看，5+10亚基组合的麦谷蛋白含量在整个籽粒灌浆期均高于4+12亚基组合。

2.3强筋小麦籽粒GMP的积累动态

对3个小麦品种GMP含量进行分析（图3）发现，籽粒发育过程中强筋小麦的籽粒GMP含量呈持续上升趋势，中筋小麦呈“下降一上升一下降一上升”趋势。具体看，花后5～15天济麦44籽粒GMP含量增速较快，花后15～25天增速缓慢，花后25～35天增速上升。济麦229籽粒GMP含量的增加趋势与济麦44相似，但其第二次高速增加期出现在花后30～35天。与强筋小麦不同的是，济麦22在小麦籽粒发育过程中，GMP含量出现两次持续下降期，分别为花后5～15天和花后25～30天，两次持续上升期在花后15～25天和花后30～35天。总体来看，在整个籽粒发育期间，强筋小麦济麦44、济麦229的GMP含量持续增加且高于济麦22。从高分子量麦谷蛋白亚基类型上看，5+10亚基组合的GMP含量在整个籽粒灌浆期持续增加，且灌浆中后期的含量均高于4+12亚基组合。

2.4强筋小麦成熟籽粒中的贮藏蛋白种类及相对含量分析

由结果（表1）可以看出，3个小麦品种共检测到53个贮藏蛋白，分为三类，包括醇溶蛋白27个、Avenin-like蛋白16个和麦谷蛋白10个。3个小麦品种的贮藏蛋白相对含量不尽相同。53个贮藏蛋白中有18个在济麦229中的相对含量高于济麦22，其中醇溶蛋白P18573和P04726在济麦229中的相对含量是济麦22的3.58倍和4.21倍，Avenin-like蛋白AOA34IY3HO和A7XUQ5在济麦229中的相对含量是济麦22的9.21倍和3.18倍，麦谷蛋白P10387在济麦229中的相对含量是济麦22的3.87倍。53个贮藏蛋白中有33个在济麦44中的相对含量高于济麦22，其中Avenin-like蛋白A7XUQ5在济麦44中的相对含量是济麦22的3.79倍，麦谷蛋白P10387在济麦44中的相对含量是济麦22的4.07倍。

3讨论与结论

小麥食品品质受籽粒蛋白与面筋蛋白含量的显著影响。籽粒贮藏蛋白在灌浆过程中逐渐积累，其积累动态表现出一定的规律性。本研究显示，籽粒醇溶蛋白含量和麦谷蛋白含量在籽粒灌浆期持续上升，这与前人研究结果相同。张容研究指出，5+10与2+12亚基组合的品质差异来源从蛋白质组分形成上看，主要是醇溶蛋白和麦谷蛋白后期的快速积累不同。本研究发现，济麦44和济麦229（5+10）的醇溶蛋白和麦谷蛋白均在花后20天之后较济麦22（4+12）快。这与张容的研究结果相似。

谷蛋白大聚合体（GMP）是麦谷蛋白的重要组成部分，是衡量小麦加工品质的指标之一。邓志英等发现，不同筋型小麦的GMP积累动态存在显著差异，强筋小麦花后10天便处于较高水平，成熟时GMP含量高于其它筋型小麦。本研究发现，籽粒灌浆过程中，强筋小麦GMP含量整体呈上升趋势，花后5～25天累积较慢，之后快速增多，花后35天含量达到最高；而济麦22籽粒GMP积累呈现“下降一上升一下降一上升”的趋势，即花后5～15天含量逐渐降低，之后逐渐增加，花后25天又降低，花后30天始又增加。总体而言，籽粒灌浆期济麦22的GMP含量低于2个强筋小麦品种。这与前人的研究结果相同，说明籽粒灌浆中后期是强筋小麦与济麦22小麦GMP含量产生差异的关键时期。

邓志英等指出，不同亚基对GMP的积累有不同影响，含5+10亚基对的品种成熟期GMP含量增幅比前期有很大提高。张容指出，5+10亚基组合的小麦品种籽粒灌浆前期GMP占籽粒蛋白质的比例较低，20天后一直维持在较高水平至成熟，说明其GMP主要是在籽粒灌浆中后期形成。本研究发现，5+10亚基组合的小麦GMP含量在整个籽粒灌浆期保持增加趋势，但济麦44在花后25天开始增速加大，而济麦229在花后30天增速加大。说明含有5+10亚基组合的小麦品种之间其GMP积累动态也存在少许差异。

利用TMT技术从3个小麦品种成熟籽粒中共检测到53个贮藏蛋白，有33个在济麦44中的相对含量高于济麦22，有18个在济麦229中的相对含量高于济麦22。分析济麦44比济麦22含量高的贮藏蛋白发现，其倍数介于1.01～4.07之间，倍数超过2的有2个。济麦229比济麦22含量高的贮藏蛋白倍数介于1.02～9.21之间，有5个倍数超过2，且AOA34IY3HO的倍数达到9.21倍。对TMT数据和麦谷蛋白、醇溶蛋白、GMP在3个小麦成熟籽粒中的含量进行分析发现，济麦44较济麦22贮藏蛋白含量高的原因是其大多数的贮藏蛋白表达量高，而济麦229高蛋白含量的原因是部分贮藏蛋白超高量表达。