星油藤根腐病镰孢属病原真菌的鉴定及其拮抗菌筛选

刘阳平 张晋媛 林瑞 阮东硕 王伟伟

关键词：星油藤；根腐病；镰孢菌属；芽孢杆菌；木霉菌

星油藤（PLukenetia VOILLbilis L．）学名南美油藤，属大戟科多年生常绿攀援性藤本植物，其种子含油量高达45%～60%，且富含多不饱和脂肪酸，以及抗氧化剂VA、VE和蛋白质等，具有较强的抗氧化性和药食保健功能，对调整人体血脂、预防心血管疾病、防衰老等作用明显，被誉为“植物脑黄金”。在我国，星油藤已被列人中国科学院支撑服务国家战略性新兴产业化项目，目前仅在云南西双版纳、海南等少数地区种植。近年来星油藤根腐病发生严重，种植3年以上的植株发病率超过50%，症状表现为根和茎基部逐渐腐烂并蔓延至全株，导致植株生长迟缓、叶片变黄、枝条枯萎，最后全株死亡。

引起植物根腐病的病原种类较多。缪作清等对三七根腐病病原进行调查和鉴定，发现真菌类群主要包括坏损柱孢菌（Cylindrocarpon de-structans）、三七黄腐病菌（C．didynum）、茄腐镰孢菌（Fusarium solani）、尖镰孢菌（F．oxysporum）、草茎点霉（Phoma herbarum）、立枯丝核菌（Rhizocto-nia solani）等。张德珍等报道引起山东省小麦根腐病的病原菌有麦根腐平脐蠕孢菌（Bipolarissorokiniana）、尖镰孢菌、层出镰孢菌（F．prolifera-tum）、黄色镰孢菌（F．culmorurn）等。严重威胁油梨产业发展的根腐病病原为樟疫霉菌（Phytoph-thora cinnamomi Rands）。目前，西双版纳星油藤种植区报道的根腐病病原为尖镰孢菌，海南省陵水县报道茄腐镰孢菌可引起星油藤根腐病。经调查发现，海南大学儋州校区星油藤种植园中根腐病亦主要由镰孢属病原真菌侵染引起，但具体种尚未见报道。

根部病害所造成的危害往往是毁灭性的，发病初期不易被发现，化学农药的施用效果不理想，并且选择性差，大量使用会严重降低土壤中有益菌群的数量，所以生物防治是植物根部病害防治的有效手段。本研究对海南大学儋州校区农科基地星油藤根腐病镰孢属病原真菌进行分离，并依据柯赫氏法则及分子生物学进行鉴定：同时筛选并鉴定具有潜在开发前景的拮抗菌株，为星油藤根腐病的生物防治提供技术支撑。

1材料与方法

1.1病原物分离与纯化

于海南大学儋州校区农科基地采集星油藤根腐病发病病根，病根用自来水冲洗后用吸水纸吸干水分，剪成长为为5mm左右小段，用2%Na-C10消毒2min，转移至PDA培养基中置于28℃培养箱中倒置培养。待长出菌落，挑取疑似镰孢菌分离物，进行纯化培养，获得纯培养物。观察分离物菌落形态，并记录、拍照。

1.2致病性鉴定

将灭菌土分装在花盆（底部直径10cm，高约12cm）中，每个花盆种植两株星油藤，放置于28℃、RH为60%～80%的温室中培养，并根据花盆中水分情况及时浇水，待星油藤长至5～6叶时，选取长势较好的幼苗从土壤中取出，并冲洗，用消毒手术刀在幼苗茎基部划一小伤口，然后用灭菌打孔器在培养7d的分离物菌落边缘取直径为5mm菌块接种在伤口处，将接种幼苗放置在铺有被无菌水浸湿的吸水纸的搪瓷盘中，用保鲜膜封住保湿。每株分离物接种10株星油藤幼苗，以不接菌为对照。每天观察发病情况并记录。待发病后，对发病部位病原菌进行分离，并鉴定是否与接种菌株一致。

1.3TEF序列扩增及测序

将分离物接种于PDA培养基上，放置于28℃培养箱中培养7d后收集菌丝，并利用TIAN-GEN植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，提取方法参照试剂盒说明书。利用引物EFl/EF2，以不同分离物基因组DNA为模板，扩增TEF序列．PCR反应体系及程序参照文献。扩增产物使用Diamond DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4系统发育树构建

将TEF序列在GeneBank数据库中进行Blast比对，确定分离物分类地位。基于TEF基因，以Nectriaceaesp.JF740829和Nectriaceaesp.JF740791為外群，使用MEGA X构建NJ树（neighbor-joining tree），利用自展分析（bootstrap，1000次重复）检验各分支的置信度。

1.5拮抗细菌的筛选及鉴定

于健康星油藤植株根部取根际土，称取10g加入90mL无菌水中混匀制成土壤悬浮液，利用梯度稀释法分离拮抗细菌，并通过平板对峙试验进行初筛。挑选具有拮抗效果的单菌落，以十字交叉法接种在距离培养皿1cm处，将致病真菌菌饼（5mm）接种在PDA培养基的正中间，置于28℃培养，以不接种拮抗菌为对照，每处理3个重复。待对照菌落长满培养皿后以十字交叉法测量菌落直径，计算拮抗菌株的抑制率。抑制率（%）=（对照组菌落直径一试验组菌落直径）／对照组菌落直径×1000

选取抑制率大于60%的拮抗细菌提取基因组DNA，以27F/1492R为引物分别扩增16SrD-NA序列，使用Diamond DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将序列输入Gene-Bank数据库中进行Blast比对，确定拮抗细菌的分类地位。

1.6拮抗木霉菌的筛选

为了筛选对星油藤根腐病具有较好拮抗效果的木霉菌株，选择1 8株木霉菌（由海南大学植物保护学院刘铜教授惠赠），分别为棘孢木霉（Tri-choderma asperellum）

（HN059、XJ087、G2070、SC012、SCI01、SC098、XJ035、NX043），猥木霉（Zennaceum） LS019-2，哈茨木霉FJ069．绿色木霉，长枝木霉以及木霉菌HN083110-2、NX036、LG004-52、ZJB3-13、LS073 -23、LG027-32（未鉴定种），分别与星油藤根腐病菌DZG-43和DZG-13进行对峙培养，筛选抑制率较高的木霉菌，并验证非挥发代谢产物对病原菌的抑制效果，对木霉菌拮抗机理进行初步研究。

1.7数据处理与分析

使用软件IBM SPSS Statistics 21（IBM Corp，Armonk，NY，USA）对数据进行统计分析，在P<0.05水平进行t检验。所有试验至少重复3次。

2结果与分析

2.1病原茵分离

在海南大学儋州校区农科基地星油藤种植园中星油藤根腐病发生严重，表现为根和茎基部逐渐腐烂，导致植株生长迟缓、叶片变黄、枝条枯萎，甚至全株死亡。采集根腐病病样，经分离纯化共获得5株分离物，分别命名为DZG-13、DZG-1、DZG-12、DZG-16和DZG-43。在PDA培养基上，分离物菌落顏色起初呈白色，之后气生菌丝呈白色至浅粉色，基内菌丝呈白色至黄色（图1）。

2.2致病性测定

通过室内接种试验，菌株DZG-13、DZG-12、DZG-43表现出较强的致病力，接种7d后接种部位出现褐色坏死病斑，并向上、向下扩展，最终导致根部腐烂，地上部死亡。菌株DZG-1和DZG-16致病力较弱，接种部位出现褐色病斑，但不扩展。对照未发病，但在根部从土壤中取出过程中导致了不可避免的损伤（图2）。在病部可重新分离获得与接种菌株相同的分离物。

2.3病原菌鉴定

将TEF基因序列提交至GeneBank数据库，菌株DZG-13、DZG-43、DZG-12、DZG-1和DZG-16的登录号分别为MW115935～MW115939。经Blast比对，DZG-13与Fusarium oxysporumKY859253和F．oxysporum MT313909相似度分别为99.05%和98.89%：DZG-16和DZG-43与F．solani MG857207和F．solani MG857198相似度均为100%; DZG-1和DZG-12与F．solanzMG857207和F．solani MG857198相似度分别为97.94%和95.43%。由图3可以看出，DZG-13与F．oxysporum AF008504聚类；DZG-1、DZG-12、DZG-16和DZG-43与F．solani聚类，且DZG-16和DZG-43亲缘关系更近。结合菌落形态特征，DZG-13鉴定为尖镰孢菌（F．oxysporurn），DZG-1、DZG-12、DZG-16和DZG-43鉴定为茄腐镰孢菌（F．solani）。

2.4拮抗细菌筛选与鉴定

拮抗细菌JK-A对镰孢属病原DZG-13、DZG-12和DZG-43的抑制率分别为68.19%、68.30%和69.70%，拮抗细菌JK-Z的抑制率分别为69.67%、68.67070和68.44%（图4）。将扩增获得的拮抗细菌16S rDNA序列分别在GeneBank数据库中比对，JK-A与Bacillus cereus序列相似性为99.72%，JK-Z与B．subtilis相似性为99.93%。初步鉴定拮抗菌株JK-A为蜡样芽孢杆菌（B．ce-reus），菌株JK-Z为枯草芽孢杆菌（B．subtilis）。

2.5拮抗木霉菌筛选

木霉菌株HN083110-2、LG004-52、NX043、ZJB3-13和绿色木霉对星油藤根腐病菌DZG-43具有较高的抑制率，分别为69.26%、67.68%、67.14%、66.35%和65.34%，显著高于其它菌株（图5A）；LG004-52、FJ069、XJ087、SC101、G2070、ZJB3-13和NX036对星油藤根腐病菌DZG-13具有较高的抑制率，分别为73.36%、73.30%、71.80%、71.75%、70.97%、70.26%和70.01%，显著高于它菌株（图SB）。选取HN083110-2、LG004-52、NX043、ZJB3-13和LG004-52、FJ069、XJ087、SC101分别验证非挥发代谢物对DZG-43和DZG-13的抑制效果，结果表明．HN083110-2的非挥发代谢产物对DZG-43抑制效果最佳，抑制率为52.94%（图5C）；FJ069的非挥发代谢产物对DZG-13的抑制效果最佳，抑制率为51.97%（图5D）。其中，LG004-52的非挥发代谢产物对两株病原菌均表现出较好的抑制效果。

3讨论与结论

镰孢属真菌是引起植物根腐病的重要病原之一。由于镰孢属真菌的多型性和易变异的特点，使该属真菌被认为是所有真菌类群中在形态分类上最难鉴定的属之一。翻译延伸因子TEF（translation elongation factor l-a）为镰孢属种水平上的系统发育提供了非常有用的信息。王琳等利用ITS、TEF和TUB基因对山西省镰孢菌种群分布及变异进行研究，发现TEF基因最适用于镰孢菌种类鉴定。

本研究依据柯赫氏法则及基于TEF基因的系统进化分析，确定镰孢属真菌的两个种F．oxys-porum和F．solani都可侵染星油藤根部引起根腐病。分离获得的5株镰孢属病原菌中有4株为F．soLani，说明F．soLani为引起星油藤根腐病的主要致病菌。此外，4株F．solani菌株菌落形态以及致病性存在一定差异，证明F．solani存在一定遗传多样性，后续可通过大量采样，对海南岛星油藤根腐病镰孢属病原真菌遗传多样性进行研究。

本研究筛选获得两株拮抗菌株JK-A和JK-Z，通过扩增16S rDNA序列并比对，拮抗菌株JK-A为蜡样芽孢杆菌（B．cereus），菌株JK-Z为枯草芽孢杆菌（B．subtilis）。芽孢杆菌JK-A和JK-Z对具有较强致病力的镰孢属病原菌DZG - 13、DZG-12和DZG-43的致病力均接近70%，可以考虑作为生防菌株进行开发。

木霉菌是一种应用较为广泛的生防真菌，对多种植物病害具有较好的防治效果。本研究通过对峙培养筛选对星油藤根腐病菌（DZG-43和DZG-13）具有较好防治效果的木霉菌，研究发现，木霉菌对尖镰孢菌（F．oxysporum）DZG-13的抑制率可以达到70%以上，优于对茄腐镰孢菌（F．solani）DZG-43的拮抗效果；其中木霉菌株LG004-52和ZJB3-13对两株病原菌均表现出良好的拮抗效果。木霉菌拮抗病原菌的机制主要包括竞争、寄生以及产生抑菌物质等，本研究对几株拮抗效果较好的木霉菌非挥发性代谢产物的抑菌效果进行了初步探究，发现HN083110-2的非挥发代谢产物对DZG-43抑制效果最佳，抑制率为52.94%：FJ069的非挥发代谢产物对DZG-13的抑制效果最佳，抑制率为51.97%。其中，LG004-52的非挥发代谢产物对两株病原菌均表现较好的抑制效果，下一步可对其非挥发代谢产物进行研究，筛选发挥主要功能的代谢物质，有望开发为防治星油藤根腐病的生物农药。