滩湖杂羊多胎基因（FecB）TaqMan 探针SNP 分型的研究

李 丹，马丽娜，施 安，王 燕，侯鹏霞，梁小军*

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西西安 712100；2.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002）

Booroola (FecB）基因是在绵羊中鉴定出的第一个高繁殖力主效基因[1]，其遗传效应是增加排卵数和产羔数[2]。目前，FecB 突变作为高产羔数的分子标记已广泛应用于绵羊育种改良中。湖羊繁殖力高、性成熟早且含有FecB 基因；而宁夏滩羊虽然肉质鲜美，但产羔率低[3-4]。为提高滩羊繁殖率，同时发挥湖羊多胎高产的优势，通过滩羊公羊和湖羊母羊进行杂交生产滩湖杂羊，通过横交固定得到滩湖杂羊群体G0、G1、G2代。本研究应用TaqMan 探针技术，对滩湖杂交羊G0，G1，G2代血液样本中的FecB 基因进行分析，将传统的常规表型选择育种方法与FecB 基因分子标记辅助选择育种技术相结合，旨在加快滩羊多胎品种(系）的选育步伐。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选配方法：试验羊来自同心荣华养殖场，滩羊公羊与湖羊母羊杂交产滩湖F1代，滩湖F1代母羊与滩羊公羊杂交产滩湖F2代，滩湖F2代母羊与滩湖F2代公羊横交固定产滩湖横交固定一世代(G0代），进一步繁殖产滩湖横交固定二世代(G1代）、滩湖横交固定三世代(G2代）。

2022 年6 月，选取核心群横交固定三个世代的滩湖杂交羊共计242 只作为试验动物，其中G0代78 只，G1代142 只，G2代22 只。

1.2 血样采集

每只羊颈静脉采血5mL，保存于EDTA 抗凝管中，采血后颠倒混匀以防止血液凝固，于-20℃冷冻保存。

1.3 DNA 提取与纯度检测

使用天根全血基因组DNA 提取试剂盒(DP318）提取，严格按照试剂盒说明书操作，使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对得到的DNA 片段的浓度和纯度进行检测。

1.4 引物及探针序列

利用Taqman 探针检测FecB 基因多态性的方法 (CN105176982A）进行FecB 检测分型 (表1）。BB 型代表FecB 基因CDS 区第746 位碱基发生A 至G 的突变(g.A746G），导致FecB 蛋白第249 的谷氨酰胺突变为精氨酸(p.Q249R），++型代表FecB 基因的CDS 区第746 位碱基未发生改变，仍为A。

表1 引物与探名序列

1.5 RT-PCR 反应体系和反应程序

RT-PCR 反应体系为6μL：基因组DNA 1μL，2×Master Mix 3μL，10μmol/L 正向、反向引物各0.3μL；10μmol/L 探针P-G 和P-A 各0.15μL，去离子水补齐至6μL。

RT-PCR 反应程 序：95℃ 10min，95℃30s，60℃60s，40 个循环。

2 结果分析

2.1 DNA 提取及检测

本试验中提取的血液基因组DNA 的OD 值为1.7～1.9，并经0.8%的琼脂糖凝胶110V 电泳20min 可见各泳道都有一条清晰的带(图1），说明基因组DNA 质量良好、无降解也无RNA 污染，可直接用于后续探针分型。

图1 DNA 琼脂糖凝胶电泳

2.2 滩湖杂羊FecB 基因TaqMan 探针分型结果

由图2 可见，FecB 基因TaqMan 探针分型显示FecB 基因在滩羊群体中具有3 种基因型，分别为BB、B+、++。

图2 FecB 基因基因分型散点图

2.3 滩湖杂羊FecB 基因基因型结果

由表2 可知，G0代、G1代、G2代的FecB 基因的等位基因频率与基因型频率，G0代群体中BB、B+、++基因型频率分别为2.56%、14.10%和83.33%，B、+等位基因频率分别为9.62%、90.38%。G1代群体中BB、B+、++基因型频率分别为28，17%、38.73%和33.10%，B、+等位基因频率为47.54%和52.46%。G2代群体中BB、B+、++基因型频率分别为18.18%、54.54%和27.27%，B、+等位基因频率分别为45.45%、54.54%。

表2 不同横交固定世代FecB 基因分布情况

3 讨论

刘秋月等[5]建立的检测FecB 突变的TaqMan探针法，是一种通过检测PCR 过程中及结束后产生的荧光信号来区分等位基因类型的SNP 检测技术[6]。该方法可进行大批量的高效检测，也是近年来广泛应用于绵羊FecB 突变的检测技术。Zhou 等[7]利用TaqMan 探针法检验FecB 突变，并统计分析了不同基因型群体的产羔率，发现FecB突变显著影响绵羊的繁殖性能。马丽娜等[8]认为FecB 基因可以作为滩羊多胎性选育的分子遗传标记，并能有效提高滩羊个体平均产羔数，通过基因型选育，还可以加快滩羊高繁品系的建立。李君等[9]研究发现，FecB 基因在黄淮杜泊羊群体中存在BB、B+、++等3 种基因型，其中B+型(杂合型）是群体中的优势基因型，BB 和B+基因型产羔数极显著高于++基因型。郭立宏[10]利用SSCP 标记对东北细毛羊FecB 基因进行检测，认为FecB 基因是控制多羔性状的主效基因，选择BB 和B+基因型母羊留作种用，可以加快东北细毛肉羊多胎品系的育成速度。

本试验利用TaqMan 探针对242 只滩湖杂交后代FecB 基因进行SNP 分型检测，结果表明，滩湖杂交后代GO、G1、G2代中存在BB、B+、++3 种基因型。随着横交固定体系的持续开展，B+基因型频率依次升高，++基因型频率依次降低，而BB 基因型理论上与B+型的规律应一致保持协同增长趋势，但G2代的BB 型低于G1代次，可能是此次试验抽取的G2群体数量太少，样本没有代表性容易被偏差个体影响整体试验结果，影响了BB 基因型在G2代群体中的分布频率。因此还需进一步扩充G2代样本量为品系选育选配提供稳定的FecB 突变背景和遗传材料。随着横交固定阶段的延伸，等位基因频率B、+等位基因变化规律与基因型频率类似。

罗生金[11]将湖羊的FecB 基因导入哈萨克羊群体中，用湖哈F1代公母羊(基因型均为B+）横交，产羔率达到172%，湖哈F1代公羊(基因型为B+）与湖哈F1代母羊(基因型为BB）横交，产羔率达到200%，而湖哈F1代公羊(基因型为B+）与湖哈F1代母羊(基因型为++）横交，产羔率为109%。李彬等[12]在滩羊群体中导入小尾寒羊的FecB 基因，古丽格娜等[13]在吐鲁番黑羊群体中导入策勒黑羊的FecB 基因，均增加了后代的产羔率。

这些成功的实例证明，在繁殖力较低的群体中导入FecB 基因，能有效地提高绵羊群体的繁殖力。

4 结论

本研究在滩羊群体中导入湖羊的FecB 基因，并采用基因检测技术选留含有B 基因的个体，提高群体的B 基因频率。因此，利用基因型选育技术，结合传统选种方法，通过选留含有B 基因的公母羊繁殖，可显著改善滩羊FecB 基因的基因型结构和基因频率，提高群体的产羔数，加快滩羊高繁品种(系）的建立。