板蓝根颗粒需氧菌总数的限度检测

刘风琴，李秀珍，李婷婷，郭树静

( 山东省德州市食品药品检验检测中心，山东 德州 253000)

板蓝根颗粒是一种由大青叶和板蓝根两种中药材共同组成的中药制剂，主要具有解毒、清热、凉血、利咽等各种功效，临床中主要应用于流行性腮腺炎、流行性感冒发热等病毒性疾病的预防和治疗，同时也是治疗病毒性肝炎的传统药物之一，针对扁平疣、带状疱疹等各种病毒性皮肤疾病也有较好的临床疗效[1]。大青叶具有凉血消斑、清热解毒的功效，主要应用于抑菌、抗病毒、抗肿瘤、增强机体免疫力和抗炎治疗中。板蓝根则具有凉血利咽、清热解毒，以及抗病毒、抗菌、增强免疫功能、抗内毒素、抗血小板聚集、抗癌等各种功效。中成药制剂在生产过程中，需要经历多个环节，这就使得它们极易被微生物污染，从而使得其安全性和质量受到影响。加强药品的微生物检验和限度测定是保证药品安全性的重要措施[2]。需氧菌总数是2020年版《中国药典》中针对非无菌产品微生物限度检查的重要项目，同时也是评价药品安全性的重要指标，其能够较好地反映出药品在生产期间是否达到了生产要求。微生物计数法主要包括了薄膜过滤法、平皿法、最可能数法，平皿法是微生物计数方法中应用范围最广的试验方法[3]。本研究根据《中华人民共和国药典》中关于控制菌检查法和微生物计数法的相关指导，构建起板蓝根颗粒的需氧菌总数限定检测方法，期望为板蓝根颗粒的质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

MLS—378L—PC 高压蒸汽灭菌器（松下健康医疗器械株式会社）；XS105DU 电子天平〔梅特勒一托利多( 上海) 有限公司〕；SHP—250 生化培养箱( 上海精宏实验设备有限公司）；BWS—27 精密恒温水槽( 上海一恒科学仪器有限公司)；HR40-IIA2 生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司)；IKA 涡旋混匀器(德国)。

1.2 试验试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基（北京路桥技术股份有限公司）；pH 7.0 无菌氯化钠·蛋白胨缓冲液（北京陆桥技术股份有限公司）；灭菌生理盐水。大肠埃希菌定量菌株（北京陆桥技术股份有限公司）；板蓝根颗粒样品（编号为QA01、QA02、QA03，中国食品药品检定研究院提供）。

1.3 试验方法

根据《中国药典》2020 年版第四部通则1105 中的平皿法进行样品需氧菌总数的检测操作。

1.3.1 样品前处理 首先取样品放置于室温环境下，运用75% 乙醇对瓶身进行擦拭，然后在生物安全柜内小心地将西林瓶盖开启。取10 mL 灭菌用水加入瓶内，将瓶盖盖好。充分溶解混合后的样品，即可作为待测供试品。在室温下放置15 min 后可进行测试。按照相同的方法获得3 份样品。

1.3.2 样品稀释 运用稀释管精准抽取上述待测样品5 mL，转移至pH 7.0 的无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液（45 mL）中，对其进行充分的振摇。混合均匀，即得1:10 的样品。抽取1 mL 的溶液加入pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（9 mL）中，混合均匀即得1:100的样品。按照上述稀释制备方法继续进行样品稀释，直至获得1:100 000 的稀释品。最终获得3 份样品。

1.3.3 样品培养 阴性对照：吸取1 mL pH 7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液，将其转移到无菌培养皿内；样品：从上述3 种稀释度的样品中分别抽取1 mL 转移到无菌培养皿中，平行两份。在倾注培养基的过程中，温度需要控制在45℃以内，并以逆时针的方向对平皿进行匀速旋转。注意不得将培养基溅到皿盖和皿边上方，使其能够充分的混匀，在其凝固之后，即可将平皿倒置于33℃的恒温箱内进行培养，持续培养3 ～5 d，注意观察菌落数量。

1.3.4 计数与报告 根据《中国药典》2020 年版中的相关要求，对平板上生长较佳的菌落进行计数识别，并如实记录检测结果。

2 结果与分析

2.1 样品检测结果

根据结果来看，相同稀释度两个平板的菌落数结果非常接近，这就表明试验具有较好的平行性，同时结果准确度较高。阴性对照试验无菌落生长，即表明试验操作中未出现被污染的情况，结果有效。从QA01 样品中选取1:1000 稀释度来实施检测，结果显示为37 000 cfu/mL。针对QA02 样品选取1:10 与1:100稀释度进行检测，结果显示为1500 cfu/mL。而QA03的样品无菌落生长。见表1。

表1 样品检测结果（cfu/mL）

2.2 能力验证结果

根据中国食品药品检定研究院能力验证结果来进行满意度评价，即以≤2表示满意，2＜≤3表示可疑，＞3表示不满意。若三个样品结果均表示为满意，最终结果即可判定为“满意”，若其中一个存疑或不满意，即判定为“存疑”或者“不满意”。根据表2 来看，本次测定结果表示为满意，尽管QA03 中的指定值＜1，但本次测试结果为＜10 cfu/mL，即表明结果满意。但为了能够提升样品的检出限，此后针对未知样品实施需氧菌总数计数检验期间，可以针对供试品原液实施计算。

表2 能力验证评价表

3 结论

3.1 板蓝根颗粒需氧菌总数计数

为了充分了解板蓝根颗粒的需氧菌总数计数情况，本次测试采取平皿法微生物计数法按照《中国药典》中相关要求进行了实验操作，根据结果反馈情况来看，本次实验能够有效掌握板蓝根颗粒中的需氧菌总数计数情况。同时，在具备这种能力之后，也能够更为客观地评价实验室技术能力与管理水平，还能够将其作为重要且非常有效的实验室外部质量控制手段。

3.2 质量控制分析

3.2.1 实验前的准备控制 在接收到样品之后，应当及时对样品的完整性进行检查，若样品存在污染或者破损等问题，就必须及时联系机构做出处理。在接收到样品之后必须尽快对其进行检测。在进行实验操作期间，所采用的各种吸管、培养基、镊子等均必须根据相关要求来实施灭菌处理，同时及时验证灭菌效果。为了避免因高压灭菌导致培养基量和稀释液的减少，或者为了能够最大程度上控制传递中的污染问题，所有的稀释液与培养基都需要配置相应的硅胶塞，并做好独立包扎吹。在对吸管实施灭菌处理之前，上端需要增加小段棉花，避免外界杂菌进入到管内或者不慎将菌液抽吸出管外，引起不必要的污染问题[4]。

3.2.2 样品制备和稀释过程控制 在实验操作之前首先需要将样品放置到室温条件下，运用75% 的乙醇充分擦拭瓶盖，在安全柜内完成无菌瓶相关操作，并向瓶内缓慢加入灭菌水，在样品充分混合之后再根据要求来进行后续操作。根据《中国药典》中需氧菌总数的控制限度，对样品进行稀释处理，各个样品需要配置两个平板，这期间必须确保菌液具有较好的均匀性，同时在完成稀释处理前后，均需要在混匀器上实施充分的混匀处理。混匀期间必须对力度进行严格控制，以防有飞溅引起污染。而根据本次结果来看，要更好地提升样品的检出限，可以采取原液来实施计数检测[5]。

3.2.3 计数观察控制 胰酪大豆胨琼脂培养基平板在进行培养之后的2 d 内就能够实施计数观察，以防菌落数覆盖导致计数结果受到影响。此后，分别需要再次对培养第3 d、4 d、5 d 的情况进行计数。需要注意的是，必须尽量保持在超净工作台内计数，注意不得将培养皿的盖子开启，轻拿轻放，以免出现自身和交叉污染情况[6-7]。

总而言之，根据《中国药典》中微生物限度检查法对板蓝根颗粒的需氧菌总数计数进行测定，较好地掌握了需氧菌数量情况，为板蓝根颗粒的质量控制提供了客观指导。