桑椹中多糖和酚酸类化学成分的含量测定及相关性研究

王 芬，郑玲玲，李 慧*，黄璐琦

（1.江西中医药大学 院士工作站，江西 南昌330004；2.中国中医科学院中医药健康产业研究所，江西南昌330029；3.江西中医药健康产业研究院，江西 南昌330029；4.中国中医科学院，北京 100700）

桑椹为桑科植物桑Morus albaL.的干燥果穗，有滋阴补血、生津润燥的功效[1]。现代药理学研究表明，桑椹具有增强免疫功能[2]、抗氧化[3]、抗炎镇痛[4]、降血糖[5]、降血脂[6]、抗癌[7]、解酒护肝[8]以及抑菌[9]等药理作用。桑椹中主要含有多糖类、酚酸类、黄酮类及花色苷成分，2020 年版《中国药典》并未对桑椹的各类成分进行整体分析或某一特定成分的含量进行规定，使得桑椹饮片的质量控制理论基础相对薄弱。桑椹活性成分中，多糖和酚酸类研究较多，研究表明多糖具有抗氧化、降血糖等作用[10-11]，绿原酸等酚酸类成分具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑菌、护肝等作用[12-13]。本研究以不同产地、不同批次桑椹药材为研究目标，采用硫酸-苯酚法对桑椹中多糖含量进行测定，同时采用超高效液相色谱法测定绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸3 个酚酸类成分的含量，并将含量测定结果分别进行初步对比研究，探索桑椹中多糖与3 种酚酸类化学成分之间是否具有相关性，以期为桑椹饮片的质量控制以及质量标准提升提供参考。

1 仪器与材料

Waters H-Class 型超高效液相色谱仪（PDA 检测器，美国Waters 公司）；UV-1900i 型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；XSR205DW/A 型电子分析天平（江西鼎技科学仪器有限公司）；MILLI-Q IQ-7005 型纯水仪（江西鼎技科学仪器有限公司）；KQ5200DE 型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

乙腈（Merck）、磷酸（Macklin）为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

绿原酸 （批号：YRL0098200419）、新绿原酸（批号：CR-069200117）、隐绿原酸（批号：YRY0026210420）纯度均大于98%，均购自宝鸡市翊瑞生物科技有限公司。对照药材（编号：S-1，批号：121158-201804）购自中国食品药品检定研究院，其余批次桑椹药材的产地及批号见表1，样品均由江西杏林白马药业股份有限公司提供，统一粉碎后过筛，备用。

表1 桑椹产地及批号Tab.1 Origin and batch number of mulberry

2 方法与结果

2.1 桑椹多糖含量测定

2.1.1 溶液的制备 对照品溶液：精密称取无水葡萄糖对照品适量，加水制成0.1 mg/mL 葡萄糖对照品溶液。供试品溶液：取桑椹药材0.5 g，加入25 mL纯水，80℃水浴1 h，收集上清液，重复提取2 次，合并上清液，65℃旋蒸，定容10 mL，加入四倍体积的95%乙醇，4℃冷藏24 h 后，8 000 r/min 高速离心15 min，收集沉淀，加水溶解至100 mL 容量瓶，定容后摇匀，即得。

2.1.2 标准曲线的绘制 分别精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置具塞试管中，加水补至2.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，精密加入硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，置40℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（X, μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为Y= 10.009X+ 0.057 8，r= 0.999 3,表明葡萄糖在10.93 ～ 54.65μg/mL 内线性关系良好。

2.1.3 精密度试验 取同一对照品溶液，于490 nm波长处重复测定6 次吸光度，RSD 为0.15%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 取同一批桑椹饮片，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、20、40、60、80、100、120、150、180、210、240、300、330、360 min 于490 nm 波长处测定吸光度，RSD 为2.18%，表明桑椹样品在360 min 内稳定性较好。

2.1.5 重复性试验 取同一批桑椹饮片6 份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别于490 nm波长处测定其吸光度，RSD 为1.27%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验 精密称取已知多糖含量的桑椹饮片0.25 g，共6 份，按照1 ∶1 的关系加入葡萄糖对照品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，于490 nm 波长处测定其吸光度，计算平均回收率，结果见表2。

表2 加样回收率实验（n = 6）Tab.2 Sample recovery experiment（n = 6）

2.1.7 样品多糖含量测定 取桑椹饮片0.5 g，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别于490 nm波长处测定其吸光度，计算得多糖含量，结果见表3。

表3 多糖含量测定结果（mg/g，n = 3）Tab.3 Results of polysaccharide content determination（mg/g，n = 3）

2.2 桑椹中3 种酚酸类成分含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（1.8μm，2.1 mm×100 mm）；乙腈为流动相A，0.1%磷酸水为流动相B，梯度洗脱条件见表4；检测波长：325 nm；流速：0.2 mL/min；柱温：30℃；进样量：1 μL。

表4 梯度洗脱条件Tab.4 Gradient elution conditions

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取一定量绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸对照品，加入甲醇配制成新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的质量浓度分别为0.377 6 mg/mL、0.393 3mg/mL、0.365 2 mg/mL 的对照品母液，分别吸取上述对照品母液1 mL，加入甲醇稀释成新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的质量浓度分别为15.728 μg/mL、15.104 μg/mL、14.608 μg/mL 的混合对照品溶液，摇匀，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 称取桑椹粉末0.5 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，加入80%甲醇溶剂25 mL，称重，置于90℃水浴锅中加热回流1h，冷却补足失重，过滤，滤液过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.4 系统适用性考察 吸取对照品溶液、供试品溶液和试剂空白溶液，分别按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图见图1。各化合物的峰均能达到良好分离。

图1 混合对照品（a）及桑椹供试品（b）UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of mixed standard（a）and mulberry test substance（b）

2.2.5 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品母液各1 mL 置于10 mL 容量瓶加甲醇稀释并定容至刻度，制成混合对照品溶液，依次稀释2 倍、4 倍、8 倍、16 倍、32 倍、64 倍，按“2.2.1”项下色谱条件，依次进样，以对照品溶液质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，以峰面积（Y）积分值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程，见表5。

表5 桑椹中3 种成分标准曲线和线性范围Tab.5 Standard curves and linear ranges of the 3 components in mulberry

2.2.6 精密度试验 吸取同一桑椹饮片供试品溶液1μL，按“2.2.1”项下色谱条件，连续进样6 次，测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸峰面积积分值RSD 分别为0.98%、2.61%、1.46%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 吸取同一供试品溶液1μL，分别在0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h 进样，测定峰面积积分值RSD分别为1.72%、1.96%、1.60%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.2.8 重复性试验 取同一批次桑椹样品，按“2.2.3”项下方法制备6 份供试品，按“2.2.1”项下色谱条件，分别进样1μL，测定峰面积，计算其RSD 值。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的RSD 分别为1.52%、1.73%、1.77%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 精密称取已知新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸含量的桑椹饮片粉末0.25 g，分别按照1 ∶1 的关系加入绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸对照品溶液，按“2.2.3”项下方法操作，平行制备6 份样品，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表6。

表6 桑椹中3 种成分加样回收试验结果（n = 6）Tab.6 Recovery experiment of 3 components in mulberry by sample addition（n = 6）

2.2.10 桑椹中酚酸类成分含量测定 取不同产地不同批次桑椹样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量，结果见表7。

2.3 桑椹多糖与酚酸类成分含量相关性研究

将桑椹中多糖和酚酸类成分含量测定结果构建相关系数图，以相关系数为指标，其绝对值越接近1，则成分之间相关性越强。以不同产地桑椹为研究对象时，桑椹多糖与新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸三种酚酸类成分含量不具有相关性，而不同产地桑椹饮片三种酚酸类含量测定结果表明，绿原酸与隐绿原酸含量之间具有明显相关性，见图2。以同一产地不同批次桑椹饮片为研究对象时，桑椹多糖与新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸三种酚酸类成分的相关系数分别为-0.42、-0.33、-0.32，同样不具有相关性，但三种酚酸类成分之间，其相关系数均接近1，所以绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸三者含量具有明显相关性，见图3。

图2 不同产地桑椹多糖和3 种酚酸类成分相关系数图Fig.2 Correlation coefficients of mulberry polysaccharide and 3 phenolic acids from different origins

图3 同一产地不同批次桑椹多糖和3 种酚酸类成分相关系数图Fig.3 Correlation coefficients of mulberry polysaccharide and 3 phenolic acids in different batches from the same origin

3 讨论

通过对桑椹多糖含量测定前处理考察，对不同前处理方式（经乙醚脱脂后80%乙醇提取；不同浓度乙醇前处理；不同浸提次数以及浸提温度等）进行除杂效果对比，明确以水浸提后95%乙醇对多糖醇沉可以实现除杂，且多糖提取率较高。优选了最大吸收波长490 nm，并对桑椹饮片粉末不同粒径（24、50、65 目）、取样量（0.25、0.5、1.0 g）以及浸提时间（1.0、1.5、2.0 h）等进行优化，结果表明，桑椹饮片打粉后过50 目药典筛，测得多糖含量明显高于过24 目筛的样品；取0.5 g 桑椹测得多糖含量高于0.25 g，且与1.0 g 结果接近；提取1 h 和1.5 h 含量无明显变化；提取2 次多糖含量明显高于提取1 次的结果。故最终确定多糖含量测定提取方法为：取0.5 g 过50 目药典筛的桑椹粉末，加水提取1 h，提取2 次。

通过PDA 检测器提取不同波长下色谱图，经对比研究后发现三个酚酸类成分的最大吸收波长均在325 nm左右，同时分别考察了25、30、35℃三个柱温下的分离效果，并考察了流速0.2、0.25、0.3 mL/min，最终确定检测波长：325 nm，柱温：30 ℃，流速：0.2 mL/min 作为酚酸类成分含量测定的色谱条件。

通过考察不同提取方式［超声提取（200 W，40 kHz）、回流提取］，桑椹粉末不同粒径（50、65、80 目），不同取样量（0.2、0.5、1.0 g），不同提取时间（30、60 min）、不同提取溶剂（甲醇、80%甲醇、50%甲醇、无水乙醇、80%乙醇、50%乙醇），综合目标峰峰形以及三种目标成分含量为优化指标，最终确定酚酸类成分含量测定供试品制备方法：取0.5 g 桑椹饮片粉末（65 目），以80%甲醇回流提取60 min。

实验结果表明，不同产地之间桑椹饮片中桑椹多糖含量与酚酸类含量差异较大，但不存在相关性，而酚酸类成分中绿原酸与隐绿原酸含量之间具有明显相关性；在同一产地不同批次桑椹饮片中，桑椹多糖含量与酚酸类化学成分之间也不存在明显相关性，但3 种酚酸类成分之间存在明显相关性。综合上述实验结果，不同产地不同批次桑椹中，绿原酸与隐绿原酸含量具有明显相关性，而同一产地不同批次桑椹中，绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸含量具有明显相关性。由此可知，不能以多糖或酚酸类等某单一成分对桑椹饮片质量进行评价，或作为质控成分建立标准，应该综合考虑不同成分，多指标多维度对桑椹饮片进行定性或定量的综合评价。

4 结论

桑椹药材中多糖与酚酸类成分含量不具有明显相关性，桑椹质量控制提升应综合考虑桑椹活性成分含量及其药理作用。通过对不同产地以及不同批次药材进行含量测定对比研究，能够更加全面了解桑椹药材中某一成分或多个成分的总体水平，对桑椹的多糖与其它化学成分含量相关性以及桑椹内在质量关系还需进一步研究。参考文献[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典: 一部[S].北京: 中国医药科技出版社, 2020: 340.[2] 姚肖华.桑葚多糖对妊娠小鼠免疫功能的影响[J].营养学报, 2013,35(5): 492-495.[3] 王馨悦, 陈华国, 周 欣.6 种常见食材抗氧化及抑制乙酰胆碱酯酶活性[J].江苏农业科学, 2019, 47(15): 208-212.[4] 吴志琴.桑椹果实抗炎活性成分筛选及其作用机理研究[D].深圳:深圳大学, 2015.[5] 王 强, 王 睿, 王 存, 等.桑葚多糖调节血糖代谢及体外抗氧化效果研究[J].食品科学, 2014, 35(11): 260-264.[6] 刘学铭, 黄小霞, 廖森泰, 等.3 种富含花青素植物提取物抗氧化和降血脂活性比较研究[J].中国食品学报, 2014, 14(1): 20-27.[7] 王 湛, 付钰洁, 常 徽, 等.桑椹花色苷的提取及对人乳腺癌细胞株MDA-MB-453 生长的抑制[J].第三军医大学学报, 2011, 33(10): 988-990.[8] 王 静, 丁海燕.酚酸类化合物抑菌作用研究进展[J].中成药, 2022,44(6): 1906-1911.[9] 段江莲, 徐建国.桑椹红色素抑菌作用的研究[J].食品科学, 2007, 28(10):87.[10] 王 杏, 邓青芳, 陈华国,等.桑椹多糖的结构表征及其对乙醇脱氢酶活性的影响研究[J].中国中药杂志, 2017, 42(12): 2329-2333.[11] 董 强, 李 阳, 国锦琳.桑椹多糖研究进展[J].中药与临床, 2021,12(4): 77-80.[12] 韦丽文.不同成熟度桑椹多酚绿原酸含量测定及抗氧化活性研究[J].中国现代中药, 2019, 21(7): 946-950.[13] 刘 莹, 覃骊兰, 蓝毓营.桑葚化学成分、药理作用及质量标志物研究进展[J].重庆医学, 2021, 50(6): 1063-1067.