γ-干扰素释放试验在结核病专科门诊诊断儿童活动性结核病的效能

马婷婷 岳英 严文 漆沄 杨翰 马进宝

全球每年新发儿童结核病约有109万,且有20万儿童死于结核病[1]。因获取病原学困难、临床表现不典型、医务人员认识不足等问题,儿童结核病的早期诊断存在一定的困难[2]。γ-干扰素释放试验(IGRA)可通过检测患儿静脉血中T淋巴细胞对结核特异性抗原刺激产生的免疫反应判定是否感染有结核分枝杆菌。研究认为IGRA辅助诊断结核病的优点包括:1)敏感度及特异度较高;2)准确性不受卡介苗接种及绝大多数NTM感染的干扰;3)受机体干扰小[3-4]。IGRA在辅助儿童结核病诊断中得到广泛应用[5]。然而研究表明IGRA辅助诊断结核病的准确度可能受人群、年龄、卡介苗接种史及结核病接触史的影响[6-8]。本研究旨在分析在结核病专科门诊,IGRA在不同类型患儿中诊断活动性结核病的效能。

资料与方法

一、研究对象

本研究为回顾性研究,连续纳入 2019年1月至2021年12月就诊于西安市胸科医院结核病门诊的268例疑似结核病患儿为研究对象,纳入和排除标准:(1)纳入标准:①因疑似结核病就诊;②年龄≤14岁;③行IGRA检测。(2)排除并发肿瘤、自身免疫性疾病、HIV感染及免疫抑制剂使用者及其它可能导致免疫力低下的疾病。 本研究遵循赫尔辛基宣言,并经过西安市胸科医院伦理委员会批准(R2020-003-01),受试者在纳入研究时,获得了其父母或法定监护人的知情同意。

二、结核病诊断标准

根据中华人民共和国卫生行业标准《结核病分类》(WS 196—2017)将结核病分为:潜伏感染,原发性肺结核,继发性肺结核,血行播散型肺结核,淋巴结结核,其它肺外结核及非活动性结核病[9]。根据中华人民共和国卫生行业标准《肺结核诊断》(WS 288—2017)将结核病诊断分为:疑似病例,临床诊断病例,确诊病例。疑似病例:因具备结核病症状、影像学表现或免疫学检查之一而怀疑结核病;临床诊断病例:具备结核相关症状及体征,同时IGRA或TST检查阳性;确诊病例:结核菌抗酸染色、结核菌培养、分子生物学阳性或病理符合结核改变。[10]临床诊断病例和确诊病例统称为活动性结核。

三、γ-干扰素释放试验(IGRA)

采用结核感染T细胞检测试剂盒(购自北京万泰公司),该方法分体外抗原刺激全血培养释放γ干扰素(INF-γ)和用 ELISA法定量测定INF-γ两步。采集研究对象静脉血4 mL,分装到背景管、检测管和阳性管各1 mL,于37 ℃培养(22+2)h,1 500 r/min离心10 min×2 200 g,取上清液用ELISA方法检测,得到各管吸光度值(A值),A值输入配套软件自动判读结果。在获得仪器结果时,观察阳性管是否呈阳性反应,若阳性则表示试验成功,若阴性则建议患者重新进行采样检测。在观察背景管A值过高时,为排除操作不当引起的阳性管交叉污染等原因,同样建议患者重新进行采样检测。

结核菌素皮肤试验(TST):在左前臂掌侧前1/3中央皮内注射5 IU PPD,至局部出现7～8 mm大小的圆形橘皮样皮丘。72h(48 h～96 h)检查反应,以皮肤硬结为准。阴性(-):硬结平均直径<10 mm;硬结平均直径≥10 mm,或出现双圈及水泡为阳性。

四、信息采集

在电子病例系统检索2019年1月至2021年12月就诊于西安市胸科医院结核门诊所有患者,筛选其中年龄小于等于14岁患儿,在电子病例系统中收集患儿身份证号、性别、卡痕情况、结核病密切接触史,IGRA及TST检测结果及诊断。所有信息均由专人收集,并且做匿名收集以保护患者隐私权益。

样本量计算:采用单样本诊断性试验计算样本量,根据既往文献预计敏感度90%,特异度为90%,容许误差均为10%,要求双侧检验, α为 0.05,考虑20%的丢失率,采用PASS 15软件计算得到样本量n=150例。

五、统计学处理

采用area under the ROC curve (AUC)评估IGRA诊断结核病准确性,0.7>AUC≥0.5准确度差,0.9>AUC≥0.7准确度一般,AUC≥0.9准确度高。使用MedCalc 18.2.1软件分析受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积,曲线下面积差异性分析使用Z检验,检验水准α=0.05。

结 果

一、患者纳入情况及一般资料

2019年1月至2021年12月,共有268例患儿因疑似结核病就诊,排除15例未做IGRA检测患儿,7例可能存在免疫功能低下的患儿,共246例患儿纳入研究,纳入流程见(图1)。纳入研究患儿男女比例为135 ∶111。最小年龄2月11天,最大14岁,69例年龄≤5岁,177例年龄为5～14岁。191例诊断为结核病,55例诊断为非结核,患者诊断分布(见表1)。结核病患者中病原学阳性80例,病原学阳性率41.9%(80/191)。56例患儿有明确结核病密切接触史,190例接触史不明确或无接触史。41例患儿未见卡痕,33例未记录卡痕情况,172例可见卡痕。所有患儿HIV检测均阴性。

图1 患儿纳入排除流程图

表1 患儿诊断分布(n=246)

二、IGRA在不同类型患儿中诊断活动性结核病效能分析

15例IGRA检测缺失案例,分析时给予删除;33例卡痕记录缺失,在分析是否有卡痕组中IGRA诊断效能时给予删除缺失值案例;16例TST结果缺失,在分析TST联合IGRA诊断效能时删除缺失值个案。

(表2)展示了活动性结核病患儿IGRA阳性率为80.6%(154/191例),非结核病患者IGRA阳性率36.4%(20/55例)。IGRA诊断结核病敏感度、特异度、AUC分别为80.6%、63.6%、0.74。20例IGRA阳性的非结核患儿中3例诊断为肺炎,3例为陈旧性肺结核,10例未明确诊断,4例为非结核分枝杆菌。37例IGRA阴性的诊断结核病患儿,19例结核病原学阳性(抗酸染色、培养或分子生物学阳性),10例经病理穿刺诊断为结核病,8例TST检测阳性并诊断为活动性结核。

表2 IGRA诊断儿童活动性结核病效能

不同类型患儿中,IGRA诊断儿童结核病效能(见表3),年龄≤5岁组AUC(95%CI值)为0.71(0.62～0.80),6～14岁组AUC(95%CI值)为0.75(0.70～0.81),两组差异无统计学意义(Z=-0.848,P=0.40)。可见卡痕组AUC(95%CI值)为0.72(0.67～0.78),未见卡痕组AUC为0.72(0.61～0.83),两组差异无统计学意义(Z=0.067,P=0.946)。有密接史组AUC(95%CI值)为0.83(0.75～0.91),无密接史组AUC(95%CI值)为0.72(0.66～0.77),两组差异有统计学意义(Z=2.336,P=0.020)。

表3 不同类型患儿中IGRA诊断活动性结核病效能

三、IGRA联合TST诊断儿童活动性结核病效能分析

(表4)中展示,有230例患者同时进行了TST及IGRA检测,其中TST阳性176例,阴性54例。在临床诊断结核病患儿中TST阳性率为85.9%(152/177例)。IGRA联合TST诊断儿童结核病敏感度、特异度、AUC分别为89.3%、49.1%、0.79。与TST单独诊断儿童结核病比较,其AUC差异无统计学差异(Z=1.598,P=0.110)。

表4 TST及IGRA联合TST诊断儿童活动性结核病效能

讨 论

IGRA-Gamma干扰素释放试验(IGRA)是利用结核分枝杆菌株系表达的抗原刺激外周血单核细胞产生IFN-γ,根据IFN-γ释放情况判断是否感染结核分枝杆菌,目前临床检测IFN-γ的方法有化学发光法,T-spot等。本研究使用化学发光法,相对于T-spot具有检测通量大,仪器自动化程度高的特点。化学发光法虽然减去了血液本底的非特异IFN-γ,但是在刺激过程中可能产生非特异IFN-γ而影响其准确性。本研究中,疑似结核病患儿中活动性结核病的罹患率较高为77.6%。活动性结核病患儿IGRA阳性率为80.6%,但IGRA诊断活动性结核病准确度一般,AUC为0.74。IGRA诊断活动性结核病准确性在无密切接触史患儿中准确度较低。尽管IGRA联合TST诊断活动性结核病准确性高于单用TST,但差异并无统计学差异。

IGRA检测阳性提示患者存在结核感染[3],对于结核是否处于活动状态无法给出结论。但由于仅20%～41%的患儿能够获得病原学依据[11- 12],IGRA成为儿童结核病临床诊断的重要条件之一[10]。然而本研究发现在结核病专科门诊IGRA辅助诊断活动性结核准确度一般,AUC为0.74,其结果与van Loon等报道的0.77接近[13],但低于Patrizia等报道的0.92[14]。既往研究报道IGRA诊断结核病的敏感度及特异度各有差异,敏感度为20%到100%[15-18],特异度为63%到99%[13, 19-21]。这种结果的差异可能与患儿的人群、结核病诊断标准、营养状态、卡介苗接种史、HIV感染情况等有关。本研究中以结核病专科医院疑似结核病患儿为研究对象,大部分患儿可能已在综合医院经过筛查,高度怀疑结核病,因此导致IGRA阴性患儿中活动性结核仍较多,导致其特异度下降。因此我们认为在结核病专科门诊,IGRA阴性并不能很好的排除结核病诊断。

Blandinières等发现IGRA在婴儿中敏感性为40%,1岁至5岁组为77%,5岁至15岁组为82%,IGRA敏感性随年龄增加而增加[22]。简贵香等研究中发现从0岁到18岁儿童中,敏感度随着年龄增加从70.6%增加到89.3%[8]。上述研究以及其他研究[23-24]均表明IGRA诊断结核病敏感性与年龄有关。本研究中IGRA诊断结核病敏感度在小于5岁患儿为66.1%,明显低于大于5岁患儿的86.7%,因此在临床应用中需考虑患儿的年龄情况。

本研究发现无明确结核病接触史患儿IGRA诊断结核病准确性较低。结核病为呼吸道传染性疾病,对于有密切接触史患儿的监测非常重要,Lena Ronge等认为,结核菌暴露等级每增加1单位,IGRA结果将增加0.6 unit/mL[25],Khadija Said等研究认为在结核病高负担国家有家庭密接史和无密接史患儿中IGRA阳性率无差异,但结核发病人数在有结核接触史患儿中略高[26]。因此对于儿童患者需要完善其结核病密接史,必要时对其家庭成员进行筛查。

与IGRA检测比较,结核菌素试验(TST)可能会受到卡介苗接种、NTM感染的影响,因此在诊断结核感染时IGRA和TST可能会出现结果不一致情况[27],研究发现不一致在卡介苗接种患儿中更容易发生[28-29]。Babak Pourakbari等发现IGRA的特异度高于TST,作者建议用TST替代IGRA诊断儿童潜伏感染。Hiroyuki Shimizu等建议鉴于IGRA与TST结果不一致较多,应联合两种方法诊断儿童结核病[30]。Kristen等对IGRA阴性患儿进行了3年的随访,未见1例患儿发展为结核病,作者认为IGRA对结核感染可能更有价值。[31]以上研究表明TST与IGRA不一致较常见,但如何使用两种方法仍未有定论。本研究发现IGRA联合TST后并未有效提高其诊断活动性结核病能力,结果与既往研究一致[16, 32]。Auguste等认为应考虑患者发展为活动性结核的风险程度,联合使用IGRA和TST诊断结核潜伏感染[33]。因此笔者认为在临床中使用两种方法诊断结核时,应综合考虑患儿感染结核的风险程度、经济情况、可操作性等。

本研究的不足在于,对照组样本量略有不足,导致部分亚组中事件发生不足,但本研究总样本量大于预计样本量对以上不足可能有弥补;20例IGRA阳性患儿应为结核潜伏感染,且有10例未明确诊断,可能降低了IGRA诊断结核病的效能;研究为回顾性研究,信息来自病历系统,患儿的密切接触史及卡痕的信息收集可能存在偏倚。排除标准中排除了免疫缺陷的儿童,研究结果对于存在免疫功能低下的患儿可能不适用。

尽管存在以上不足,但本研究以结核病专科门诊疑似结核病患儿为研究对象,发现在结核病专科门诊IGRA诊断儿童结核准确性一般,为结核病门诊使用IGRA辅助诊断儿童结核病提供依据。我们发现在无密切接触史患儿中IGRA诊断结核病准确性较低,因此在上述患儿中使用IGRA时可能需要考虑更多的临床信息。