栀子提取物对局灶性脑缺血损伤模型大鼠凝血功能及脑血管内皮功能的影响

王碰治,侯志婷,黄家福,林毅胜

脑缺血主要指脑血液供应不足,难以供应脑组织正常的生理代谢,进而发生一系列症状的综合征[1]。脑缺血为常见的中老年人疾病,长期严重威胁人类健康,近年来该病发病率呈年轻化趋势,是我国目前重点防治的疾病之一[2]。脑缺血主要危害脑组织的健康,轻微局灶性脑缺血无明显症状,严重的局灶性脑缺血引起凝血及纤溶系统异常,造成血管内皮细胞受损,进一步破坏抗凝、抗血栓作用,进而导致神经功能等多种功能性障碍,因此,凝血功能及脑血管内皮功能是判断局灶性脑缺血的重要指标[3]。目前局灶性脑缺血以药物治疗为主,但手段单一,造成治疗效果不完善,近年来采用中草药配合预防脑血管疾病,应用于临床治疗的研究逐渐增多,已成为研究的热点[4]。

栀子属茜草科植物,作为中国药典收录品种,在我国民间有悠久的用药历史[5]。现代研究表明,栀子提取物(gardenia extract,GE)主要含有栀子苷类、西红花苷类、栀子素类等化学成分,具有多种药理活性,可促进血液循环,防治动脉粥样硬化和脑出血等[6]。尽管GE的药理活性已被广泛证实,但其对脑缺血组织的作用机制尚未明确。GE是否参与调节脑血管内皮活性、促进生物凝血功能,进而改善脑组织缺血损伤的机制尚未明确[7-8]。本研究以局灶性脑缺血损伤模型大鼠为研究对象,观察GE对凝血功能及脑血管内皮功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器 GE为实验室采集新鲜干燥的栀子制备(UPLC测定有效成分栀子苷含量>60%,西红花苷>10%),一氧化氮(nitric oxide,NO)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(货号：ER0148)购自武汉菲恩生物科技有限公司,大鼠血管壁血栓素A2(vascular wall thromboxane A2,TXA2)ELISA检测试剂盒(货号：BH-R101190)购自上海博湖生物科技有限公司,凝血酶活性荧光检测试剂盒(货号：AS-72130)购自AnaSpec公司,内皮组织纤维溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,t-PAT)ELISA检测试剂盒(货号：ZK-R3361)购自深圳子科生物科技有限公司,纤维溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor,PAI)ELISA检测试剂盒(货号：ml003024)和大鼠血浆前列环素I2(prostaglandin I2,PGI2)ELISA检测试剂盒(货号：TW3899)购自上海通蔚生物科技有限公司,酶联免疫检测仪(DG5033A,南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)。

1.2 动物模型的构建 清洁级SD大鼠48只[购自天津医科大学肿瘤医院,许可证号SYXK(津)2017-0005],随机分为假手术组(sham组)、模型组(model组)、GE高剂量组(GE-H组)、GE低剂量组(GE-L组),每组12只。所有大鼠麻醉处理,sham组大鼠颈部切开,分离左侧总动脉、颈内动脉、颈外动脉,保留完整血管,缝合各层皮下组织和肌肉,消毒处理。分离model组、GE-H组、GE-L组大鼠左侧总动脉、颈内动脉、颈外动脉后,使用电热烧灼器烧掉颈外动脉分支,分离颈外动脉主干段,结扎处理。剪开一个小口,插入尼龙线栓子,插入深度为20 mm,阻断供血1 h后恢复大脑血流,缝合各层皮下组织和肌肉,消毒处理。待动物苏醒,参照Longa神经学评分标准进行评分,0分：正常,无神经功能缺损;1分：右侧前爪无法完全舒展,轻度神经功能缺损;2分：行走时,大鼠朝右侧转圈,中度神经功能缺损;3分：行走时,大鼠身体朝右侧倾倒,重度神经功能缺损;4分：不能自主行走,丧失部分意识。GE-L组和GE-H组分别在大鼠脑缺血处理后每日腹腔注射10 mg/mL、100 mg/mL的GE 1 mL,连续注射2周;sham组和model组腹腔注射等量生理盐水。2周后再采用Longa神经学评分标准评定model组、GE-H组、GE-L组大鼠神经功能恢复情况。

1.3 凝血功能及脑血管内皮功能指标 凝血功能指标：药物注射治疗2周后,剪断大鼠尾部末端,迅速收集300 μL血液,采用凝血酶活性荧光检测试剂检测凝血酶时间(thrombin time,TT)、凝血酶含量及凝血因子Ⅹa含量;将鼠尾静脉血滴到载玻片上,每隔10 s使用大头针由外侧向内侧轻挑,直至出现纤维蛋白丝为止,记录用时即为凝血时间(coagulation time,CT)。同时使用滤纸每隔10 s吸附尾尖溢出血液,直至出血停止,记录用时即为出血时间(bleeding time,BT)。血管内皮功能指标：凝血功能指标检测后,断头处死大鼠,分离取出大脑动脉环(Willis),按照ELISA检测试剂盒方法检测Willis动脉环NO、eNOS及血浆PGI2含量和内皮组织t-PAT、TXA2及PAI活性。

1.4 脑组织病理学变化 处死大鼠后迅速开颅,解剖获取脑组织,分离脑缺血区组织,使用4%多聚甲醛固定24 h,乙醇梯度脱水,包埋剂处理后切片,苏木精染色3 min,清水冲洗2 min,低浓度盐酸乙醇分化处理,清水冲洗直至返蓝,0.5%伊红染色3 min,清水冲洗2 min,乙醇梯度脱水,二甲苯染色透明,中性树脂封片,置于显微镜下观察病理学变化。

2 结 果

2.1 各组大鼠凝血功能指标比较 与sham组比较,model组CT、BT、TT缩短,凝血酶生成及内源性、外源性凝血因子Ⅹa生成升高(P<0.05);与model组比较,GE-H组和GE-L组CT、BT、TT延长,凝血酶生成及内源性/外源性凝血因子Ⅹa生成降低(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠凝血功能指标比较(±s)

2.2 各组大鼠脑血管内皮功能指标比较 与sham组比较,model组t-PAT、PGI2、NO、eNOS降低,PAI、TXA2升高(P<0.05);与model组比较,GE-H组和GE-L组t-PAT、PGI2、NO、eNOS升高,PAI、TXA2降低(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠脑血管内皮功能指标比较(±s)

2.3 各组大鼠治疗前后Longa神经学评分比较 与sham组比较,model组治疗前后Longa神经学评分升高;sham组和model组治疗前后Longa神经学评分比较,差异无统计学意义(P>0.05);与治疗前比较,GE-H组和GE-L组治疗后Longa神经学评分降低,差异有统计学意义(P<0.05);与model组治疗后比较,GE-H组和GE-L组治疗后Longa神经学评分降低(P<0.05)。详见表3。

表3 各组Longa神经学评分比较(±s) 单位：分

2.4 局灶性脑缺血损伤模型大鼠脑组织病理变化 sham组大鼠脑组织结构完整,未出现坏死灶及脑出血组织,神经细胞排列紧密,无明显的细胞核融合现象;model组大鼠脑组织出现坏死灶,发生局部脑出血组织,脑出血组织内神经细胞排列松散,细胞核融合;GE-H组和GE-L组未见坏死灶,少量神经细胞排列紊乱,无明显的细胞核融合现象;GE-H组脑组织损伤情况及细胞核融合现象较model组明显好转,且优于GE-L组。详见图1。

图1 各组脑组织病理学变化(×200)

3 讨 论

脑缺血症状复杂多样,常造成病人多方面功能衰弱甚至缺失,使病人出现凝血功能异常,严重时导致内皮细胞破损,内皮功能异常[9]。GE具有多种药理活性,其中主要的有效成分栀子苷证实具有促进内皮细胞增殖和修复的作用[10],但其作用机制和作用途径尚未明确。本研究通过检测凝血功能和脑血管内皮功能指标,结合HE染色观察,观察GE对局灶性脑缺血大鼠功能的影响。

凝血过程主要分为凝血酶的生成、酶原的激活及纤维蛋白的形成[11]。为了观察凝血功能的变化,本研究通过检测BT、CT得到凝血过程中的基础数据,判断各组间凝血用时的差异。凝血酶将血浆中的可溶性纤维蛋白转换为不溶性纤维蛋白,从而快速凝血,故采用TT反映纤维蛋白的形成过程,判断纤维蛋白形成时间[12]。凝血因子Ⅹ在出血时被凝血酶原激活为凝血因子Ⅹa,与血小板共同参与凝血,修复损伤[13],因此使用凝血酶含量及凝血因子Ⅹa含量判断凝血酶生成量及凝血酶原激活情况。本研究结果显示,脑缺血损伤处理后大鼠CT、BT、TT缩短,凝血酶和凝血因子Ⅹa生成升高,提示脑缺血损伤过程中凝血作用异常增强;GE处理后,CT、BT、TT延长,凝血酶和凝血因子Ⅹa含量降低,表明GE使局灶性脑缺血损伤大鼠体内产生了明显的抗凝血效应,改善了体内的凝血功能。

NO是生物体内重要的舒张血管因子,在内皮血管中分泌,参与调节血管舒张程度,对血栓形成、动脉粥样硬化等具有抑制作用,而eNOS直接催化NO活性,两者可作为判断脑血管内皮功能的重要指标[14]。PAI是一种纤溶酶原激活抑制物,浓度过高时抑制纤溶系统活性,是形成血栓、破坏内皮细胞功能的主要因子之一[15]。PGI2和t-PAT均由内皮细胞合成和释放,其中PGI2与TXA2维持动态平衡,平衡失调直接导致血栓及内皮损伤[16],而t-PAT可促进纤维蛋白的溶解,降解纤维蛋白原和凝血因子,降低凝血作用[17]。本研究将t-PAT活性的增强、PAI表达下降及PGI2高表达作为判断脑血管内皮功能正常的重要指标,同时t-PAT也可作为判断凝血功能的重要指标。本研究结果显示,脑缺血损伤处理后t-PAT、PGI2、NO、eNOS降低,PAI、TXA2升高,表明脑缺血损伤处理导致脑血管内皮功能严重受损;GE处理后,t-PAT、PGI2、NO、eNOS升高,PAI、TXA2降低,表明GE可修复局灶性脑缺血损伤大鼠脑血管内皮功能,使脑血管内皮功能逐渐恢复正常。t-PAT含量变化进一步证实了GE对局灶性脑缺血损伤大鼠凝血功能的改善作用。经GE处理后,HE染色结果证实,大鼠脑组织损伤情况减轻,且Longa神经学评分结果表明,大鼠神经功能得到改善,说明GE通过改善凝血功能和内皮功能可减轻局灶性脑缺血损伤大鼠的脑组织损伤并提高神经功能。

综上所述,GE作用后,可延长CT、BT、TT,降低凝血酶和凝血因子含量,发挥明显的抗凝血作用;增强NO、eNOS活性,舒张血管,提高t-PAT、PGI2表达同时抑制PAI、TXA2的表达,改善血管内皮功能,调节纤溶功能,进而改善局灶性脑缺血损伤大鼠脑组织病变情况,恢复神经功能。GE在治疗脑血管疾病中具有很大的潜力,而GE能否通过其他作用途径间接参与调控凝血功能及脑血管内皮功能,进而恢复神经功能,或通过改善缺血脑组织其他功能缓解脑组织受损,需要在今后的研究中进一步深入挖掘和探讨。