大麻白绢病生防菌贝莱斯芽孢杆菌的筛选鉴定及发酵条件优化

王芳，曹璐，秦菁菁，林宇丰，许秀美，张政兵，李新文，李毅，程毅，孙正祥

(1.长江大学农学院，湖北 荆州 434000；2.中国农业科学院麻类研究所/南方经济作物研究中心，湖南 长沙 410221；3.湖南农业大学园艺学院，湖南 长沙 410128；4.湖南农业大学植物与保护学院，湖南 长沙 410128；5.湖南省植保植检站，湖南 长沙 410006)

大麻(Cannabis sativaL.)是我国传统的经济作物，目前为止，科研人员已从大麻植株中提取并鉴定出560 多种化学功能成分[1]。 大麻二酚因其潜在的治疗作用，包括保护神经、抗癫痫、抗癌症[2]及抑菌消炎[3]等功效而愈来愈被看好。 我国大麻种植区广阔，逐渐形成南部地区以花叶为主、东北地区以纤维为主、中部地区以籽粒为主的产业布局[4]。 大麻白绢病是由半知菌齐整小核菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)引起的一种严重土传病害，主要危害植株茎基部和根部，发病严重时常导致整株枯死。

目前大麻白绢病的防治方式主要是轮作、土壤消毒以及施用化学农药，但该病菌可以以菌核形态在土壤中存活多年，部分药物虽有一定的防效，但长期使用化学药剂容易产生耐药性。 因此，挖掘安全、绿色的生防微生物资源，开发新型生物防治办法意义重大。 柴阿丽等[5]从土壤中分离得到一株副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)ZF480，该菌株对十字花科根肿病有良好防治作用，且该菌株对镰孢菌和黄单胞野油菜变种也有较好的抑制作用。 王亚娇等[6]从西瓜根围土中分离获得一株对西瓜枯萎病具有防治效果的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SFJ11，该菌株可以分泌多种胞外水解酶，如蛋白酶和纤维素酶等，此外，该菌株在大田试验中防治效果可达78%，其防效显著高于多菌灵的(55.45%)。 许丽婷等[7]从马铃薯根际土中获得一株对立枯丝核菌有较强拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XC-1，该菌株通过造成立枯丝核菌菌丝断裂而抑制菌丝生长。 大田试验表明，菌株XC-1 在马铃薯收获期对马铃薯黑痣病生防效果达到54.51%。 植物内生菌不仅应用于生物防治，其内生菌本身还可以产生与植物相同或相似的生物活性物质，一般认为抑菌活性物质的合成和分泌是细菌最重要的生物防治机制之一，活性物质如表面活性素、脂肽类物质等都可作为药剂开发利用。 于洪升等[8]从银杏植株中筛选到一株粗提物有较好抗真菌活性的青霉属真菌，该真菌粗提物对红色毛藓菌的抗菌活性与阳性对照化学药剂氟康唑的抗菌活性相当，这一发现为寻找新的抗菌活性化合物代替原有化学药剂开辟了新的途径。QIN 等[9]从热带雨林中的植物里获得一株具有抗菌活性的放线菌，为新型抗结核药物的研发提供了新的方向。

课题组人员从云南省工业大麻种植区的健康大麻叶片组织中分离出多株内生生防菌，其中一株对大麻白绢病菌具有显著拮抗作用。 本研究对该菌株进行了形态学、分子鉴定、生理生化特征测定研究，并结合单因素试验和响应面法优化该菌株发酵条件，旨在分离大麻内生细菌，并从中筛选挖掘大麻白绢病生防菌资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料

大麻植株叶片，用于分离大麻内生菌；

供试菌株:大麻白绢病菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)(工业大麻叶片内生菌)，用于筛选大麻白绢病原生防菌。

1.1.2 培养基

肉膏蛋白胨培养基(Luria-Bertani 培养基/LB 培养基):蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，PH 7.0～7.2；马铃薯葡萄糖培养基(potato dextroseagar，PDA):土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，PH 7.0～7.2；发酵基础培养基:牛肉膏8 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0～7.2。

1.1.3 供试土壤

湖南农业大学湘辉农业技术中心研制通用型营养基质土。

1.1.4 主要试剂和仪器

恒温培养箱:SPX-250B-Z 型，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；超低温冰箱:DW-HL528型，中科美菱低温科技有限责任公司；梯度PCR 仪:T100TM Thermal Cycler 型，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；电泳仪:DYY-6C 型，北京六一仪器厂；凝胶成像系统:Tanon 2500 型，上海天能科技有限公司。

细菌基因组提取试剂盒(TIANamp Bacterial DNA Kit):擎科生化科技有限公司购买；细菌鉴定常用引物、PCRmix 及DNA marker:擎科基因股份有限公司提供。

1.2 生防菌的分离筛选和鉴定

收集健康工业大麻植株叶片，选取1 g 叶片组织，捣碎后置于9 mL 无菌水中，漩涡振荡。 将悬浮液稀释为10-1、10-2以及10-3三个浓度梯度，每个浓度吸取100 μL 悬浮液涂布至LB 固体培养基平板上，重复3 次。 平板放于28 ℃恒温培养箱过夜培养36 h，挑选菌落划线纯化。 采用平板对峙培养法将大麻白绢病菌菌饼(直径为6 mm)接种于PDA 平板(半径为4.5 cm)中心，将生防菌点接至距平板中心2.5 cm 处，以点接无菌液体培养基的平板为阴性对照组，以点接药剂苯醚甲环唑(100 倍、200 倍、400 倍和800 倍)的平板为阳性对照[10]，每个处理3 个重复。 2 d 后对照组菌落长满全皿，测量点接生防菌平板菌丝生长半径。

1.3 024A 菌株鉴定

1.3.1 形态学观察

将内生菌024A 接种到LB 固体平板上，30 ℃条件下恒温培养，光学显微镜下观察菌落生长形态；吸取OD600为0.8 的培养物，离心后弃培养基，收集菌体沉淀于管底，用1×PBS 缓冲液洗2 次，弃上清，沿管壁缓慢加入4 ℃预冷的戊二醛固定液，采用扫描电镜进行形态显微观察。

1.3.2 生理生化鉴定

参照《伯杰细菌鉴定手册》(第9 版)对菌株进行生理生化鉴定。

1.3.3 16S rDNA 基因序列分析

采用煮沸法提取细菌DNA[11]；细菌扩增通用引物:B27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和U1492R(5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；PCR 反应体系(25 μL):Supper Mix 22 μL，DNA模板1 μL，引物(10 mol/L)各1 μL；反应条件:98 ℃5 min；98 ℃30 s，56 °C 30 s，72 ℃1 min，32个循环；4 ℃保存；扩增产物送至擎科生物公司，序列在GenBank 中进行BLAST 比对，采用MEGA 7.0 构建系统发育树。

1.4 菌株024A 对大麻白绢病的盆栽防效测定

在PDA 平板上培养大麻白绢病原菌3 d，在菌丝长满培养皿后，用无菌打孔器取直径6 mm 的菌饼。 用无菌针刺伤工业大麻根部，将菌饼置于基部附近，裹上无菌棉球并喷湿(有利于大麻白绢病菌发病)。 试验共设2 个处理，每个处理设置9 盆长势相似的大麻幼苗，每盆生长有1 株大麻幼苗。接种病原菌后处理组于大麻根基部(土壤表面)喷施20 mL 024A 菌液，菌液浓度达1.0×107cfu/mL，以喷施等体积无菌培养液为对照。 幼苗放置于(24±0.2)℃温室中生长，在处理后第3 天，参照YANG等[12]方法并加以改进，计算病情指数和相对防效。 大麻白绢病病情指数分级如下[13]:

0 级:无病斑；

1 级:枯萎范围较小，占根茎比例少于1/4；

2 级:枯萎范围较大，占根茎比例达1/4～1/3；

3 级:枯萎范围极大，占根茎比例达1/3～3/4；

4 级:成株枯萎，根部坏死。

病情指数=∑(各级病株数×病情级别数)/(植株总株数×最高病情级别数)×100。

相对防治效果(%)=(1-处理组病情指数/对照组病情指数)×100%。

1.5 菌株024A 发酵条件优化

1.5.1 发酵优化结果

以大麻白绢病菌为靶标菌，采用平板对峙法测定024A 菌株发酵液对大麻白绢病菌的抑菌率，并在波长600 nm 下测定024A 菌株发酵液的OD值，结合两者检测不同试验设计下菌株024A 抑菌活性，每个处理进行3 次重复。

1.5.2 单因素法筛选最优碳源、氮源

利用单因素试验寻找发酵培养基最优碳源和氮源。 碳源供选择种类有葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油和麦芽糖，浓度为2%；氮源供选择种类有胰蛋白胨、牛肉粉、酵母浸出粉、氯化铵，浓度为1%。024A 菌株种子液接种量为2%，将种子液接入装有10 mL 培养基的锥形瓶(50 mL)中，28 ℃、180 r/min震荡培养24 h，测定菌株024A 在波长600 nm 处吸光度及024A 对大麻白绢病菌抑菌率，每个处理重复3 次。

1.5.3 Box-Behnken Design 设计

应用Design-Expert 软件设计试验方案，以前期获得的最优碳源(A)、最优氮源(B)、发酵温度(C)和发酵时间(D)为影响因素，菌株024A 对大麻白绢病菌抑菌率(Y)为响应值，进行4 因素3 水平响应面试验(表1)，试验分25 组进行，包括3 个中心点重复。 通过Design-Expert 软件基于二次多项式回归模型建立设计空间。

表1 Box-Behnken 中心组合因素水平编码表Table 1 Factors and levels in Box-Behnken center-united experiment design

1.5.4 结果分析

应用Design-Expert V8.0 软件对试验数据进行分析，方差分析和回归方程采用F检验进行显著性检验，p＜0.05 代表差异显著。 采用R2表示多元回归模型拟合度，R2＞0.9 判断为优。p＞0.05说明拟合度失拟(Lack of Fit)不显著，表明回归模型与数据拟合良好。

2 结果与分析

2.1 生防菌的分离和筛选

从大麻植株的叶片组织中分离筛选到多株对大麻白绢病原菌有拮抗作用的内生菌。 其中，菌株024A 对白绢病菌的抑制率最高，达到75.0%(图1)，显著高于阳性对照苯醚甲环唑药剂稀释液处理的平板对峙(表2)。

图1 菌株024A 对大麻白绢病原菌的拮抗结果Fig.1 Inhibitory effect of strain 024A on mycelial growth of Athelia rolfsii

图2 药剂苯醚甲环唑对大麻白绢病病原菌的拮抗结果Fig.2 Antagonistic results of difenoconazole against pathogen of cannabis southern blight

表2 024A 及醚甲环唑药剂稀释液对辣椒白绢的平板对峙结果Table 2 Plate confrontation results of 024A and diluent of ether methylcyclazole on Athelia rolfsii

2.2 024A 菌株的菌种鉴定

2.2.1 形态学特征

将菌株024A 在LB 固体培养基划线培养1 d，菌株024A 的菌落呈乳白色，圆形或椭圆形，表面光滑，边缘规则(图3A)，2 d 后024A 表面变干燥，呈褶皱状。 其革兰氏染色结果呈阳性(图3B)，通过扫描电子显微镜观察菌株024A 的超微结构，在电镜下024A 菌体为杆状(图3C)。

图3 菌株024A 的菌落形态及扫描电镜观察Fig.3 Colony morphology and scanning electron microscopic observation of strain 024A

2.2.2 生理生化特征

参照芽孢杆菌的生理生化特性，对024A 的氧化酶反应、接触酶和水解明胶等生理生化指标进行鉴定，结果显示，菌株024A 能分解利用D-葡萄糖、蔗糖，可以水解明胶和淀粉，接触酶反应、氧化酶反应呈阳性，吲哚试验和柠檬酸盐还原反应呈阴性(表3)。

表3 024A 生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain 024A

2.2.3 024A 16S rDNA 分子鉴定:

通过DNA 提取、PCR 扩增和测序获得024A16S rDNA 基因片段，该片段在GenBank 上进行比对，结果表明，该菌株与Bacillus velezensis(OP435762.1)序列相似性达到100%。 利用芽孢杆菌属不同种菌株的16S rDNA 基因序列构建进化树，发现菌株024A 与贝莱斯芽孢杆菌具有较高同源性，同源性达91%(图4)。

图4 基于16S rDNA 基因序列构建菌株024A 的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain 024A based on 16S rDNA sequence

结合形态和生理生化鉴定结果，确定菌株024A 为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，上传数据至GenBank，其登录号为OP477121.1。

2.3 生防菌温室防效试验结果

在工业大麻幼苗期刺伤根部后接种2 块大麻白绢病菌菌饼，024A 菌液灌根处理，浇灌同体积无菌水作对照。 结果显示，接种工业大麻白绢病菌6 d 后，对照组几乎完全发病，发病率和病情指数分别为77.8%与75.0，而处理组分别为22.2%与19.4(图5)，024A 相对防效为32.24%(表4)。表明菌株024A 对大麻白绢病具有良好的防效。

图5 生防菌024A 对大麻白绢病的生防效果Fig.5 Control effect of strain 024A on industrial hemp southern blight disease

表4 内生菌024A 对大麻白绢病防治效果Table 4 Control effect of endophytic bacteria 024A on industrial hemp southern blight

2.4 024A 菌株优化

2.4.1 氮源、碳源优化

最佳氮源和最佳碳源优化结果如图6、表5、表6。 其中葡萄糖作为碳源时抑菌率和OD600值均达到最大(表4)，故选择葡萄糖作为发酵碳源。 随葡萄糖浓度增加，024A 细胞数呈现先增大后减少的趋势(图6a)，葡萄糖浓度达到10 g/L 时细胞数达到峰值，所以斜面响应试验葡萄糖浓度取10 g/L为零水平。 酵母粉作为氮源时抑菌率和OD600值均达到最大(表6)，故选择酵母粉作为发酵碳源。 随酵母粉浓度的增加，024A 细胞数呈现先增加后减少的趋势(图6b)，酵母粉浓度达到15 g/L时细胞数达到峰值，所以斜面响应试验葡萄糖浓度取15 g/L 为零水平。

图6 氮源、碳源优化结果Fig.6 Optimization results of nitrogen and carbon sources

表5 不同碳源对菌株生长量及抑菌率的影响Table 5 Effects of different carbon sources on strain growth and inhibition rate

表6 不同氮源对菌株生长量及抑菌率的影响Table 6 Effects of different nitrogen sources on strain growth and inhibition rate

2.4.2 024A 发酵条件响应面优化试验结果与分析

结合碳源与氮源优化结果，通过Design-Expert 软件基于二次多项式回归模型建立设计空间，试验结果见表7、8。 结果表明，当酵母粉浓度14.12 g/L、葡萄糖浓度11.84 g/L、发酵温度31.56 ℃、发酵时间17.91 h 时，菌株024A 达到最优发酵条件。 拟合得到二次回归数学模型:Y=-630.85+22.19A+6.56B+24.00C+18.31D-0.04AB-0.04AC-0.12AD+0.06BC-0.01BD-0.11CD-0.64A2-0.37B2-0.371C2-0.39D2，该模型中，相关系数R2=0.95，说明该模型拟合较好，模型回归极显著(p＜0.000 1)，说明该模型可用于024A 发酵滤液抑菌率的预测。F值分析结果表明，4 个要素对抑菌率均有显著影响，且每两个因素之间存在一定的交互作用。 方程失拟项为1.98＞0.05，表明其失拟不显著，说明模型较稳定，能够很好地进行预测。

表7 Box-Behnken 中心组合试验设计及菌株024A 发酵优化试验结果Table 7 Design of Box-Behnken center-united experimentandresults of fermentation optimization test of strain 024A

表8 回归模型方差分析及显著性检验Table 8 Variance analysis of regression model and significance test

由图7A、7B、7C 可知，酵母粉浓度取值一定时，随着葡萄糖浓度由5 g/L 增加到15 g/L、培养温度由27 ℃升高至33 ℃、培养时间由12 h 延长至20 h，024A 菌株对大麻白绢病菌抑菌率都表现出先升高后降低的趋势；由图7A 及7D、7E 可知，葡萄糖浓度取值一定时，随着酵母粉浓度由10 g/L增加到205 g/L、培养温度由27 ℃升高至33 ℃、培养时间由12 h 延长至20 h，024A 抑菌率都表现出先升高后降低的趋势。 而上述结果的响应面分析图和曲面图都为凸面图，说明抑菌率有最大值。 通过求解回归方程，得到024A 发酵滤液抑菌率最大时的发酵条件为:酵母粉浓度14.12 g/L、葡萄糖浓度11.84 g/L、发酵温度31.56 ℃、发酵时间17.91 h，预测抑菌率最高可达89.270 3%。

图7 各影响因素对024A 抑菌率的响应面分析图及等高线图Fig.7 Response surface analysis and contour map of influence factors on 024A antibacterial rate

2.4.3 模型验证

根据前文回归方程模拟024A 最优培养条件，进行3 次重复实验验证，抑菌率分别为87%、86%和90%，平均为87.66%，与预测值89.270 3 较接近，证实了模型的可靠性。 与菌株024A 未进行培养基条件优化时的平板对峙抑菌率(75.00%)相比，优化后024A 的抑菌率提高了12.60%。 优化后得到的024A 发酵条件为:酵母粉浓度14.12 g/L、葡萄糖浓度11.84 g/L、发酵温度31.56 ℃、发酵时间17.91 h。

3 讨论与结论

芽孢杆菌属、假单孢菌属和农杆菌属的细菌作为土壤和植物的内生微生物，在生物防治中发挥着重要的作用，贝莱斯芽孢杆菌因其丰富的次生代谢物质而应用广泛。 贝莱斯芽孢杆菌不仅可以有效抑制病原菌的生长，且对植物的生长有促生作用。 张小利等[14]发现贝莱斯芽孢杆菌对草莓白粉病有较好的防效。 王安琪[15]发现贝莱斯芽孢杆菌可以显著促进玉蜀黍根部生长。 本试验中贝莱斯芽孢杆菌024A 可以有效抑制大麻白绢病菌生长，盆栽试验中024A 对大麻白绢病的防效能够达到87.1%。

优化菌株发酵条件能使菌株在有限的培养条件下产生更多功能代谢产物，进而提升菌株总体防效和菌株活性物质产量。 黄慧婧等[16]发现发酵条件优化后的TR-1 上清液对青枯菌的抑菌率约为优化前的2 倍，极大提高了TR-1 发酵液抑菌效果。 刘京兰等[17]对内生菌解淀粉芽孢杆菌CC09 产Iturin A 培养发酵条件进行优化，结果显示，发酵条件优化后可显著提高菌株CC09 产抗菌脂肽Iturin A 的能力。 戴蓬博等[18]发现通过优化培养基可以显著提高极长链霉菌菌株SL01 发酵产物的抑菌活性，极大增加菌株SL01 在紫外线条件下抑菌活性的稳定性。

前期从工业大麻叶片组织中分离出多株可以有效抑制大麻白绢病原菌的细菌。 本研究中菌株024A 对大麻白绢病菌的平板抑制率最高，抑菌率达75.0%，远高于白绢病常用杀菌剂苯醚甲环唑(56.1%)抑菌率。 综合024A 菌株形态学、生理生化特性以及16S rDNA 基因的系统发育分析结果，鉴定024A 菌株为贝莱斯芽孢杆菌。 盆栽试验结果表明，024A 防治效果达到87.1%，该结果表明菌株024A 能有效地防治大麻白绢病。 本研究利用单因素试验和斜面响应试验对菌株024A 进行发酵条件优化，获得菌株024A 的最佳发酵条件:酵母粉浓度14.12 g/L、葡萄糖浓度11.84 g/L、发酵温度31.56 ℃、发酵时间17.91 h，该条件下的菌株发酵液对大麻白绢病菌抑菌率达87.66%。

本试验通过优化024A 发酵体系，024A 对大麻白绢病菌的抑制率由75.0%提升到87.6%，显著提高了贝莱斯芽孢杆菌024A 对大麻白绢病菌的抑制作用。