过表达CBX7调控PTEN/Akt信号通路干预上皮-间充质转化抑制胃癌细胞迁移、侵袭

谭 斌,刘剑波,李芳芳,彭 艳,钟月圆,邓 晖,王秀丽 （郴州市第一人民医院中心医院消化内科，湖南 郴州 423000）

胃癌是消化道恶性肿瘤之一，其发病率在我国恶性肿瘤中居第2位，病死率居第3位[1]。近年来，医学技术的进步、手术方法的改进、免疫治疗及新辅助化疗的应用极大地延长了胃癌患者的生存期，然而肿瘤转移和复发仍不可避免，导致胃癌患者预后差、生存质量低[2-3]。因此，深入研究胃癌发展、转移的分子机制极为必要。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肿瘤远处转移过程中的关键步骤之一，临床上，EMT与癌症预后不良密切相关[4-5]。染色体盒蛋白同源物7（chromosome box protein homologue 7，CBX7）是多梳蛋白家族中的一员，属于黑腹果蝇的异染色质蛋白在人类细胞中的同源物，主要分布于细胞核的染色质中，通过与染色质结合发挥作用[6]。CBX7的表达与多种癌症的不良预后和侵袭转移相关，在癌症发生和进展中起着重要的作用[7-8]。研究发现，CBX7在胃癌组织中低表达，其低表达与胃癌患者的不良预后和生存率低显著相关[9]，CBX7通过p16和Akt/NF-κB/miR-21信号通路调节胃癌细胞的干细胞样特性[10]。但CBX7对胃癌细胞迁移、侵袭及EMT的影响尚不明确。因此，本研究就CBX7对胃癌细胞迁移、侵袭及EMT的影响展开探讨，并分析其潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胃癌细胞SGC7901（中国科学院细胞库）；CBX7过表达质粒和阴性对照质粒、CBX7 siRNA和阴性对照siRNA（上海吉玛生物公司）；RPMI-1640培养基（深圳华晨阳科技有限公司）；Lipofectamine 2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司）；CCK-8试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；结晶紫染色液（武汉卡诺斯科技有限公司）；Matrigel基质胶、Transwell小室（美国BD公司）；CBX7和GAPDH引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；兔源GAPDH、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、磷酸酶张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen，PTEN）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）单克隆抗体及生物素偶联的IgG二抗（英国Abcam公司）。

Heracell VIOS 160i细胞培养箱（美国Thermo Fisher公司）；PT-3502PC多功能酶标仪（北京普天新桥技术有限公司）；WMF-3690型倒置荧光显微镜（上海无陌光学仪器有限公司）；JY-ZY5型电泳仪（济南君意生物科技有限公司）；RTQ-960 Pro qRT-PCR仪[艾康生物技术（杭州）有限公司]；KETA GL型凝胶成像系统（北京好亿科技发展有限公司）。

1.2 细胞培养

人胃癌细胞SGC7901置于RPMI-1640培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，培养箱温度为37 ℃，CO2浓度为5%。

1.3 细胞转染与分组

按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书，将CBX7过表达质粒和阴性对照质粒、CBX7 siRNA和阴性对照siRNA转染至对数生长期的SGC7901细胞，依次记为pcDNA-CBX7组、pcDNA-NC组、si-CBX7组和si-NC组，同时将正常培养的细胞作为阴性对照组（NC组）。转染48 h后检测转染效率。

1.4 qRT-PCR法检测细胞中CBX7 mRNA表达水平

收集各组SGC7901细胞，采用TRIzol试剂提取RNA并进行定量，用反转录试剂盒反转录合成cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书配置实验体系，进行qRT-PCR检测。引物序列如下：CBX7上游引物为5'-CATGGAGCTGTCAGCCATC-3'，下游引物为5'-CTGTACTTTGGGGGCCATC-3'；GAPDH 上游引物为5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，下游引物为5'-CAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3'。 反 应条件：95 ℃3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40 次循环。实验重复 3次，采用 2-ΔΔCt法进行分析。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖活性

各组SGC7901细胞按1×104/mL接种至96孔培养板，设置5个复孔，同时设置对照孔和空白孔，培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂孵育4 h，采用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光度（OD）值。实验重复3次，细胞存活率（%）=（实验孔OD值-空白孔OD值）/（对照孔OD值-空白孔OD值）×100%。

1.6 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

各组SGC7901细胞按1×105/mL接种至6孔培养板，培养至细胞贴壁生长后，以200 μL移液枪枪头垂直划痕，做好标记，PBS冲洗，加入RPMI-1640培养基继续培养24 h。实验重复3次，细胞迁移率（%）=（0 h划痕距离-24 h划痕距离）/0 h划痕距离×100%。

1.7 Transwell小室检测细胞侵袭能力

收集各组SGC7901细胞，取100 μL浓度为2×105/mL的细胞悬液接种至含有Matrigel基质胶包被膜的Transwell小室上室，下室添加600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，孵育24 h后，清除上室细胞，用4%多聚甲醛固定穿过膜的细胞，并用0.1%结晶紫染色20 min，倒置显微镜下观察，计数侵袭细胞数目，实验重复3次。

1.8 Western blot法检测细胞CBX7蛋白、EMT相关蛋白和PTEN/Akt信号通路蛋白表达水平

蛋白裂解液提取各组SGC7901细胞总蛋白，BCA试剂盒定量，SDS-PAGE分离蛋白样品，并湿转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭膜2 h，TBST洗膜，将膜与 CBX7、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PTEN、Akt、p-Akt、GAPDH 一抗（1∶1 000）在 4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入IgG二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL试剂显影，分析蛋白条带灰度值。实验重复3次。

1.9 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（-x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SGC7901细胞中CBX7表达水平

与NC组比较，pcDNA-NC组和si-NC组SGC7901细胞中CBX7 mRNA和蛋白表达量变化均无统计学差异（P>0.05）；与pcDNA-NC组比较，pcDNA-CBX7组SGC7901细胞中CBX7 mRNA和蛋白表达量均显著增加（P<0.05）；与 si-NC组比较，si-CBX7组 CBX7 mRNA和蛋白表达量均显著下降（P<0.05），见图1，提示转染效果良好。

图1 SGC7901细胞中CBX7表达水平

2.2 过表达CBX7抑制SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭

与NC组比较，pcDNA-NC组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数变化均无统计学差异（P>0.05）；与pcDNA-NC组比较，pcDNA-CBX7组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数均显著下降/减少（P<0.05），见图2，提示过表达CBX7抑制SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭。

图2 过表达CBX7抑制SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭

2.3 过表达CBX7抑制SGC7901细胞EMT

与NC组比较，pcDNA-NC组SGC7901细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达量变化均无统计学差异（P>0.05）；与pcDNA-NC组比较，pcDNACBX7组SGC7901细胞中E-cadherin蛋白表达量显著升高（P<0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表达量显著下降（P<0.05），见图 3，提示过表达 CBX7抑制SGC7901细胞EMT进程。

图3 过表达CBX7抑制SGC7901细胞EMT

2.4 下调CBX7表达促进SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭

与NC组比较，si-NC组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数变化均无统计学差异（P>0.05）；与si-NC组比较，si-CBX7组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数均显著升高/增加（P<0.05），见图4，提示下调CBX7促进SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭。

图4 下调CBX7表达促进SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭

2.5 下调CBX7表达促进SGC7901细胞EMT

与NC组比较，si-NC组SGC7901细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达量变化均无统计学差异（P>0.05）；与si-NC组比较，si-CBX7组SGC7901细胞中E-cadherin蛋白表达量显著下降（P<0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表达量显著升高（P<0.05），见图5，提示下调CBX7促进SGC7901细胞EMT进程。

图5 下调CBX7表达促进SGC7901细胞EMT

2.6 CBX7对SGC7901细胞中PTEN/Akt信号通路蛋白表达的影响

与NC组比较，pcDNA-NC组和si-NC组SGC7901细胞中PTEN蛋白表达量、p-Akt/Akt变化均无统计学差异（P>0.05）；与pcDNA-NC组比较，pcDNA-CBX7组SGC7901细胞中PTEN蛋白表达量显著升高（P<0.05），p-Akt/Akt显著下降（P<0.05）；与si-NC组比较，si-CBX7组SGC7901细胞中PTEN蛋白表达量显著下降（P<0.05），p-Akt/Akt显著升高（P<0.05），见图6，提示过表达CBX7通过上调PTEN抑制Akt信号通路活性。

图6 CBX7对SGC7901细胞中PTEN/Akt信号通路蛋白表达的影响

3 讨论

胃癌起源于胃壁最表层的黏膜上皮细胞，可发生于胃的各个部位，是具有高度侵袭和转移特性的恶性肿瘤。胃癌早期患者临床症状不明显，多数胃癌患者确诊时已发生远处转移，而胃癌细胞发生转移是导致胃癌患者病死率高和预后差的主要原因。因此，探究胃癌侵袭、转移的相关机制，对降低胃癌患者病死率和改善预后具有重要意义。CBX7在哺乳动物大脑、心脏及骨骼肌组织等中均有表达，可维持机体组织的正常生长发育。在细胞中，CBX7通常作为表观遗传调控因子调节基因表达，然而，在病理状态下CBX7的异常表达可导致基因表达失衡，这与肿瘤的发生、发展密切相关。在人类肿瘤中，CBX7起着双重作用，一方面其通过抑制抑癌基因促进某些癌症的进展；另一方面，其通过与不同分子的相互作用调节相关蛋白合成，进而抑制癌症进展[11-12]。在宫颈癌中，CBX7过表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，作为抑癌因子发挥作用[13]。在神经胶质瘤中，CBX7通过沉默CCNE1诱导细胞G1/S期阻滞，可作为神经胶质瘤预后标志物[14]。此外，CBX7可作为miR-19及miR-18a等多种microRNAs的靶基因，对卵巢癌、非小细胞肺癌等肿瘤细胞迁移、侵袭及EMT发挥调控作用[15-16]。但CBX7对胃癌细胞迁移、侵袭的影响尚不清楚。本研究通过调控CBX7的表达，分析CBX7对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，结果显示，过表达CBX7可抑制胃癌SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭，下调CBX7表达可促进胃癌SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭，提示CBX7可通过调控细胞增殖、迁移和侵袭而调控胃癌进展。

EMT是一个复杂的生物学过程，不仅包括细胞-细胞连接的溶解，还包括顶端外侧极性的丧失。在EMT过程中，上皮细胞失去细胞黏附蛋白（如E-cadherin）和紧密连接蛋白的表达，并同时表达丰富的N-cadherin和Vimentin等间充质标志物，从而完成从上皮到间充质的表型转化，转化后的细胞表现出细胞间黏附减少和运动性增加，使肿瘤细胞获得较强的迁移性和侵袭性[17]。研究报道，复合物CBX7-PRMT1在调节E-cadherin表达和细胞迁移中起关键作用[18]。Tian等[19]报道，CBX7表达降低与宫颈癌EMT和不良预后相关。本研究探讨CBX7表达变化与胃癌EMT的相关性，结果显示，过表达CBX7后SGC7901细胞中E-cadherin蛋白表达升高，N-cadherin、Vimentin蛋白表达下降，下调CBX7表达后SGC7901细胞中E-cadherin蛋白表达下降，N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高，提示CBX7可调控胃癌细胞SGC7901的EMT进程。

肿瘤的发生、转移过程涉及多个信号途径和多种分子机制，其中PTEN/Akt通路是近年来研究较多的相关通路之一。PTEN是一种磷酸酶，通过负调节Akt信号通路调节各种转录因子和信号分子的活性，进而调控细胞周期、细胞凋亡，并参与细胞增殖、迁移和侵袭。在胃癌发生、发展进程中，PTEN/Akt信号通路参与胃癌血管生成以及胃癌细胞增殖、迁移、凋亡和EMT等生物学过程。Zhou等[20]报道，靶向miR-21通过PTEN/Akt信号通路抑制胃癌细胞增殖和迁移。Wu等[21]报道，miR-616-3p通过PTEN/Akt/mTOR通路促进胃癌血管生成和EMT。Qiang等[22]报道，姜黄素通过调控miR-21/PTEN/Akt通路，与PD98059协同诱导人胃癌细胞凋亡。还有研究显示，CBX7可通过调节PTEN/Akt信号通路抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭[23]。本研究结果显示，过表达CBX7显著上调SGC7901细胞中PTEN蛋白表达，使Akt磷酸化减少；而下调CBX7表达则使SGC7901细胞中PTEN蛋白表达显著下调，Akt磷酸化增加。提示CBX7可通过调控PTEN/Akt信号通路参与胃癌细胞EMT进程及细胞迁移和侵袭。

综上所述，本研究证实过表达CBX7可抑制胃癌细胞增殖，并可通过抑制EMT抑制胃癌细胞迁移、侵袭，其机制可能是与调控PENT/Akt信号通路有关。因此，CBX7可能是胃癌转移和预后的相关标志物及潜在治疗靶点。