Pik3ip1通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进牛MDSCs分化

严云勤，滕怀昕，佟慧丽，李树峰，李 爽

（东北农业大学细胞与发育生物学实验室，哈尔滨 150030）

骨骼肌是人体重要器官，其强大的再生能力依赖于骨骼肌卫星细胞。肌肉卫星细胞是位于肌纤维膜和基底膜之间的肌源性干细胞[1]。在正常生理条件下，肌肉卫星细胞处于静息状态。当受到生理刺激时，如体育锻炼、急性肌肉损伤或病理条件等，静息的肌肉卫星细胞被激活，发生增殖、迁移、分化、融合等行为，形成新的多核肌管进而形成肌纤维[2]。其中转录调节因子家族（Muscle regulatory factors，MRFs）对细胞分化至关重要，肌细胞生成素（Myogenin，MyoG）基因[3]，一种转录因子家族成员，在肌肉卫星细胞分化早期表达。肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MHC）是细胞终末分化标志基因，是骨骼肌发育关键调节因子[4]。

PI3K、Wnt、Notch 及许多信号通路均影响骨骼肌发育[5]。PI3K/AKT/mTOR信号通路是调控骨骼肌分化的重要信号转导通路，参与肌肉生长发育、蛋白质合成、稳态维持等生物学过程[6]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）是组成磷脂酰肌醇激酶的重要组分，PI3K由两部分组成：调节亚基p85和催化亚基p110，调节亚基p85具有SH2和SH3结构域。蛋白激酶B（PKB，即AKT）是PI3K 主要下游靶点，AKT 磷酸化从而激活PI3K/AKT 信号通路[7]。已有研究表明，PI3K/AKT 信号通路促进肌肉卫星细胞增殖，抑制该途径后促使肌肉卫星细胞相互融合进而分化[8]。

PI3K相互作用蛋白1（Pik3ip1）被认为是一种与PI3K 调 节 亚 基p85 同 源 的 跨 膜 蛋 白[9]。Pik3ip1 是PI3K负调控因子，Li等研究表明，Pik3ip1在C2C12细胞分化过程中表达升高，促进C2C12 细胞分化[10]。新生大鼠细胞免疫共沉淀结果显示Pik3ip1与心肌细胞中p110 亚单位相互作用，Pik3ip1 敲低35%即可诱导心脏肥大[11]。Song等表明Pik3ip1缺陷导致PI3K/AKT/mTOR 信号通路激活，蛋白质合成增加，细胞变大。腺病毒介导的Pik3ip1 过度表达可减轻PI3K 介导的心肌肥大[12]。PI3K/AKT/mTOR信号通路在细胞增殖中发挥重要作用[13]。

本研究旨在探讨Pik3ip1 在牛MDSCs 分化过程中的表达，进一步将CRISPR/Cas9技术应用于上调和下调Pik3ip1表达，以探究Pik3ip1对牛MDSCs分化的影响，依赖Pik3ip1 与p110α 相互作用，并通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路影响牛MDSCs 分化，为提高牛肉品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用牛骨骼肌取自新生犊牛后腿部肌肉，在无菌条件下分离出细胞，培养出的细胞在液氮中冻存备用。

1.2 主要试剂

大肠杆菌（E.coli）DH5α 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；pSPg-RNA、SP-dCas9-VPR、SPdCas9质粒购自美国Addgene公司。高糖DMEM 培养液、opti-MEM 购自Gibco 公司；胎牛血清、马血清、青霉素、链霉素购自Biological Industries 公司；胶原酶Ⅰ、胰蛋白酶、DMSO 构自Sigma 公司；PEI 转染试剂购自Yeasen Biotechnology 公司（40816ES02）；去内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA 公司；BbsⅠ、T4DNA Ligase 内切酶购自NEB 公司；抗荧光猝灭封片剂、RIPA 裂解液、DAPI、免疫沉淀兔IgG抗体购自碧云天生物技术公司；胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司（EG101-01）；兔源GAPDH 抗体购自Abcam公司（ab9485）；兔源MyoG 抗体购自Santa Cruz 公司（SC-52903），兔源p110α 抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、FITC的羊抗兔荧光二抗购自北京Bioss 公司；兔源MHC 抗体购自Proteintech公司；Co-IP 实验所用磁珠购自美国MCE 公司（HY-K0202）；PVDF 膜（0.45 μm）购自Millipore Corporation 公司；25 mL 细胞培养瓶、六孔细胞培养板购自NEST 公司；引物序列合成、基因测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 细胞分离、培养及分化

本研究中使用的细胞是从新生犊牛（n=3）腿部肌肉中分离获得。将获得的腿部肌肉在无菌操作台中剪成肉糜状，用0.1%胶原酶Ⅰ和0.25%胰蛋白酶处理消化，采用差速贴壁方法纯化牛MDSCs。将上述分离获得的牛MDSCs 用10%FBS 的DMEM 培养基于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养。细胞密度达到60%～70%后进行传代，用0.1%胰蛋白酶消化，接种到六孔板中。培养24 h后，细胞密度达到70%，用于细胞分化或细胞转染。分化时，使用含2%马血清的DMEM培养基诱导分化。

1.4 激活和抑制Pik3ip1

针对Pik3ip1（NCBI 基因ID:512082）基因，设计三个靶向Pik3ip1 启动子预测区的sgRNAs 序列，每个靶序列5′端添加BbsⅠ酶切位点“CACC”，合成后对其进行退火并连接到pSPgRNA 表达载体，并将表达载体命名为pSPgRNA-P1、pSPgRNA-P2、pSPgRNA-P3。

转染前，将牛MDSCs 接种到六孔板中。当贴壁细胞密度达到约70%时，将三个sgRNA 载体和2 μg SP-dCas9-VPR质粒共转染至牛MDSCs以激活Pik3ip1 基因表达，或将三个sgRNA 载体和2 μg SP-dCas9质粒共转染，抑制Pik3ip1基因表达。

1.5 免疫荧光

将牛MDSCs于4 ℃下冷甲醇中固定20 min，去除冷甲醇，用PBST（含0.5%Triton X-100的PBS）洗涤3 次。细胞在37 ℃下与封闭溶液（含5%BSA 的PBST）孵育60 min。将细胞在4 ℃下用Pik3ip1 一抗（1∶100）或结蛋白一抗（1∶50）孵育过夜。在一抗孵育过后，PBST 摇床清洗细胞3 次，每次5 min，然后用FITC 标记的二抗在37 ℃下孵育1 h，滴加二抗后的所有步骤均需在避光条件下进行。二抗孵育完成后，PBST 摇床清洗细胞3 次，每次5 min。最后，在室温下用DAPI 染色3～5 min，用PBST摇床清洗细胞3次，每次3 min，然后采集图像。

1.6 免疫印迹检测蛋白含量

将含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液滴入细胞中进行裂解，收取细胞总蛋白。使用BCA 蛋白质测定法测定蛋白质浓度。SDS-PAGE凝胶电泳用于蛋白质分离，在冰浴条件下将目的蛋白转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，在4 ℃条件下一抗孵育过夜。一抗包括Pik3ip1（1∶500）、MyoG（1∶500）、MHC（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）。一抗孵育完成后，PBST 摇床清洗4 次，每次5 min。随后，将膜与HRP标记的二抗（1∶2 000）在37 ℃下孵育1 h，用PBST 摇床清洗4 次，每次5 min。使用Super ECL Plus 检测试剂盒检测目的蛋白，用化学发光成像获得图像，分析系统为Minichemi Sagecreation 发光成像系统。最后，使用Image J软件分析条带。

1.7 免疫共沉淀

将牛MDSCs 诱导分化48 h，PBS洗涤2次。含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解细胞，取出100 μL 蛋白裂解物作为阳性对照，将剩余蛋白裂解物平分。用p110α（2 μg）抗体和Protein A/G 磁珠结合形成抗体-磁珠复合体。用兔IgG抗体（2 μg）和Protein A/G 磁珠作为阴性对照，在4 ℃下摇床2 h。然后将样品12 880 r·min-1，10 min 在4 ℃下离心，去除抗体，样品加入磁珠，形成抗原-抗体-磁珠复合体，在4 ℃下摇床孵育2 h。最后加入SDS上样缓冲液，煮沸样品以洗脱结合蛋白，进行Western blot检验。Pik3ip1免疫沉淀方法同上。

1.8 统计分析

所有结果均以平均值±标准差表示。从独立实验中选择具有代表性的免疫蛋白印迹，当数据接近正态分布时，两组之间使用t 检验统计评估。NS：无显著性差异，*P＜0.05 代表显著性差异，**P＜0.01 代表极显著性差异，被认为具有统计学显著性。使用Prism软件分析所有统计测试。

2 结果与分析

2.1 Pik3ip1在牛MDSCs分化过程中的表达

利用免疫荧光和Western blot 检测Pik3ip1在牛MDSCs 分化过程中的表达。诱导牛MDSCs 分化，于分化第0、1、3和5天固定细胞，进行免疫荧光染色，结果如图1A所示，当牛MDSCs在增殖培养基（0 d）中培养时，无肌管形成，Pik3ip1 特异荧光非常弱。随分化天数增加，细胞逐渐融合形成肌管，Pik3ip1 荧光强度逐渐增强。使用Western blot检测Pik3ip1在牛MDSCs 分化过程中的表达。随分化天数增加，Pik3ip1表达（见图1B和1C）及肌分化标志基因MyoG和MHC表达均显著升高（见图1D和1E）。结果表明，Pik3ip1 表达随牛MDSCs 分化而增加。

图1 Pik3ip1在牛MDSCs分化过程中的表达Fig.1 Expression of Pik3ip1 during bovine MDSCs differentiation

2.2 Pik3ip1对牛MDSCs分化的影响

2.2.1 激活Pik3ip1对牛MDSCs分化的影响

为研究Pik3ip1 对牛MDSCs 分化的影响，使用CRISPR/dCas9 方法激活Pik3ip1 表达。首先，构建靶向Pik3ip1启动子的sgRNA载体。将重组后sgRNA载体与SP-dCas9-VPR载体共转染牛MDSCs，分化培养48 h。利用Western blot 检测选择Pik3ip1 激活后表达效果最好的载体。对照组为sgRNA 空载与SP-dCas9-VPR 载体共转染牛MDSCs，与对照组相比pSPgRNA-P3 组具有最显著的激活效果（见图2A和2B）。因此，选择pSPgRNA-P3用于后续相关试验。

图2 激活Pik3ip1对牛MDSCs分化的影响Fig.2 Activation of Pik3ip1 affectted differentiation of bovine MDSCs

将对照组sgRNA载体和pSPgRNA-P3载体分别与SP-dCas9-VPR 载体共转染，转染后分化48 h。免疫荧光和免疫印迹法检测细胞分化情况。免疫荧光结果表明，Pik3ip1 被激活后，肌管数量显著增加（见图2C），肌管融合率提高42.32%，差异极显著（见图2D）。激活Pik3ip1 后，MyoG 和MHC 表达显著增加（见图2E～2H）。上述结果表明，激活Pik3ip1表达促进牛MDSCs分化。

2.2.2 抑制Pik3ip1对牛MDSCs分化的影响

将SP-dCas9 和pSPgRNA 或pSPgRNA-Pn 共转染牛MDSCs，通过Western blot 检测Pik3ip1蛋白表达量，筛选出抑制效果最显著的载体。结果如图3所示，pSPgRNA与SP-dCas9载体共转染牛MDSCs作为对照组，pSPgRNA-P2抑制载体组中Pik3ip1表达显著低于对照组（见图3A 和3B）。因此，选择pSPgRNA-P2抑制载体进行后续相关试验。

图3 抑制Pik3ip1对牛MDSCs分化的影响Fig.3 Inhibition of Pik3ip1 affectted differentiation of bovine MDSCs

在牛MDSCs 中抑制Pik3ip1 表达，使用免疫荧光和Western blot 检测细胞分化情况。免疫荧光结果显示，抑制Pik3ip1表达后，肌管显著减少（见图3C）。统计结果显示，与对照组相比肌管融合率下降21.67%，差异极显著（见图3D）。Western blot 结果表明，Pik3ip1被抑制后，MyoG和MHC表达显著降低（见图3E～H）。以上结果表明，抑制Pik3ip1的表达导致牛MDSCs分化减少。

2.3 Pik3ip1与p110α相互作用

为进一步明确Pik3ip1 与PI3K 亚单位p110α 之间关系，将牛MDSCs 诱导分化48 h 收集蛋白样品进行免疫共沉淀。用Pik3ip1 抗体和p110α 抗体分别免疫沉淀并进行Western blot 检测，结果显示，使用Pik3ip1 抗体进行免疫沉淀后，收集的样品中可检测出p110α 蛋白（见图4A）；使用p110α 抗体进行免疫沉淀后，所得样品中可检测到Pik3ip1 蛋白（见图4B）。表明Pik3ip1在牛MDSCs 分化过程中与p110α蛋白相互作用。

图4 Pik3ip1与p110α在牛MDSCs分化过程中结合Fig.4 Pik3ip1 binds to p110α during bovine MDSCs differentiation

2.4 Pik3ip1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路影响牛MDSCs的分化

为研究Pik3ip1与PI3K/AKT/mTOR 信号通路对肌肉分化的影响，本试验激活或抑制Pik3ip1 后诱导牛MDSCs分化48 h，Western blot检测PI3K、AKT和mTOR 磷酸化状态以及分化标志基因MyoG 和MHC 表达。结果如图5 所示，当Pik3ip1 被激活，信号通路中PI3K、AKT 和mTOR 磷酸化水平显著降低（见图5A～E），MyoG和MHC表达量均增加（见图5F 和G），表明激活Pik3ip1 使PI3K/AKT/mTOR信号通路被抑制，促进牛MDSCs分化。

图5 激活Pik3ip1对PI3K/AKT/mTOR信号通路及牛MDSCs分化的影响Fig.5 Activation of Pik3ip1 affectted PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and bovine MDSCs differentiation

相反，当Pik3ip1 表达受到抑制，PI3K、AKT和mTOR 磷酸化水平升高（见图6A～E），MyoG 和MHC 表达量均显著增加（见图6F 和G）。研究结果表明，Pik3ip1通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进牛MDSCs分化。

图6 抑制Pik3ip1对PI3K/AKT/mTOR信号通路及牛MDSCs分化的影响Fig.6 Inhibition of Pik3ip1 affectted PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and bovine MDSCs differentiation

3 讨 论

本研究首次描述Pik3ip1作为牛MDSCs 分化负调控因子的功能及表达。本试验室前期研究结果表明，牛MDSCs 分化中RNA 高通量测序结果显示，分化 第3 天牛MDSCs 中Pik3ip1 的mRNA 水平显著高于未分化牛MDSCs 的mRNA 表达[14]。因此，推测Pik3ip1与牛MDSCs 分化密切相关。为明确Pik3ip1对牛MDSCs 分化的影响，本研究分离牛MDSCs 并诱导分化，结果显示，Pik3ip1 蛋白随牛MDSCs 分化过程表达增加。表明Pik3ip1 与牛MDSCs 分化存在一定关联。与Li 等发现Pik3ip1 随小鼠C2C12细胞分化表达增加的研究结果相似[10]。

为明确Pik3ip1对牛MDSCs 分化的影响，采用CRISPR/dCas9 系统达到调控Pik3ip1 表达目的，根据前期研究该系统可有效激活或抑制基因表达[15]。结果表明转染Pik3ip1 表达载体后，Pik3ip1 表达可被体外激活或抑制。表达载体的成功构建为后续试验提供参考。此外，激活Pik3ip1 促进牛MDSCs分化，抑制该基因后分化程度降低，说明Pik3ip1正向调控牛MDSCs 分化，在牛MDSCs 发育过程中发挥重要作用。

研究表明，Pik3ip1 通过其细胞内p85 结构域与PI3K的p110催化亚单位结合，下调人类肝癌细胞和小鼠心肌细胞中PI3K 活性，抑制AKT 活性[16-17]。免疫共沉淀结果显示，Pik3ip1在牛MDSCs分化过程中与p110α相互作用，与其他物种细胞中Pik3ip1 研 究 结 果 一 致。Pik3ip1 在 牛MDSCs 中 对PI3K/AKT/mTOR 信号通路的调控作用目前尚无相关研究，本研究通过激活和抑制Pik3ip1 表达，发现Pik3ip1对PI3K/AKT/mTOR 信号通路发挥负向调控作用。PI3K/AKT/mTOR 信号通路是最重要的细胞内途径之一，在细胞增殖、黏附、迁移、蛋白质合成以及细胞存活过程中发挥关键作用，同样可被视为癌症主要调节因子[18]。PI3K/AKT/mTOR信号通路上调，在肌肉发育过程中促进C2C12 细胞增殖且抑制分化[10]；Oh 等研究表明，韭菜中分离的化合物可促进小鼠骨骼肌生长分化并上调PI3K/AKT/mTOR 信 号 通 路[19]，PI3K/AKT/mTOR 信号通路在骨骼肌细胞分化过程中的作用目前存在争议。然而，该信号通路对牛MDSCs分化的影响尚不清楚。激活Pik3ip1 表达后，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路并促进牛MDSCs分化，反之亦然。本研究推测PI3K/AKT/mTOR 信号通路可能抑制牛MDSCs分化过程，这与C2C12 细胞在骨骼肌发育过程中部分结论一致。为进一步探讨PI3K/AKT/mTOR 信号通路在牛MDSCs 发育中功能，需在后续试验中添加信号通路激活剂或抑制剂深入研究。

本研究表明，Pik3ip1通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进牛MDSCs 分化。本研究加深对肌肉发育机制的了解，为改善牛肉品质提供新视角。

4 结 论

本研究发现Pik3ip1和PI3K/AKT/mTOR 信号通路在牛MDSCs 分化过程中发挥重要作用。Pik3ip1通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进牛MDSCs分化，为今后研究和改善牛肉品质提供理论基础。