水杨酸、纳米氧化锌和促生真菌YZ13-1在水曲柳抵御干旱胁迫中的调控作用

申晨静 武文博 耿露冉 王福龙 赵鹏舟 宋金辉詹亚光，3 尹 静，3*

（1.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2.齐齐哈尔龙江县错海林场，齐齐哈尔 161100；3.东北林业大学东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 1500401）

水曲柳（Fraxinus mandshurica）为木樨科（Oleaceae）梣属（Fraxinus）植物，广泛分布于中国、韩国、日本和俄罗斯等地区［1］，是我国东北地区“三大硬阔”之一。水曲柳具有干型通直、抗腐蚀性强等特性，可用做建筑、飞机、仪器、运动器材、家具等。水曲柳是东北地区天然林的主要组成树种，也是人工林的主要造林树种，在我国东北地区气候环境的保护和调节中发挥重要作用［2］。而我国东北地区的春播期和夏季的阶段性干旱严重影响了水曲柳幼苗的生长发育和成活率。干旱胁迫会造成植物体营养失衡、代谢紊乱，严重影响植物正常生长发育［3-4］。干旱使1 年生水曲柳苗木根系活力降低、膜通透性增加、可溶性蛋白含量降低，严重时可导致树木死亡［5］。因此，提高水曲柳抗旱性对其幼苗成活率及发育成材尤为重要。

诱导子是指能够诱发自身防御反应并刺激细胞合成防御性次生代谢产物的物质，包括生物和非生物诱导子，常见的非生物诱导子有紫外线、重金属、无机化合物、有机化合物如乙烯、水杨酸、草酸、茉莉酸等；生物诱导子包括真菌、昆虫等，其作用机制是调节次生代谢过程中的某些酶活性，并对某些关键酶在转录水平上进行调节，引起次生代谢途径中代谢通量和反应速率的改变，从而提高次生代谢产物的产量和提高抗逆（病）性［6-8］。水杨酸（SA）也称邻羟基苯甲酸，是植物体内普遍存在的一种小分子酚类物质，是最有效的诱导子之一，能够调节光合作用、氮和脯氨酸代谢、抗氧化防御系统等多种重要的生理过程以适应外界变化［9］。例如，干旱胁迫下，用SA喷施大麦（Hordeum vulgare）叶片能够增强其光合作用，从而增加有机物的积累［10］。在对玉米（Zea mays）的研究中发现，用SA 浸泡玉米种子可以提升种子的发芽率，同时增强了幼苗叶片的抗氧化酶活性［9］。外源施加1 mmol·L-1SA 能够提高小冠花（Securigera varia）的抗氧化能力，减少了干旱胁迫对细胞膜脂造成的过氧化损伤，从而缓解了干旱胁迫对小冠花伤害［11］。纳米氧化锌（ZnO NPs）具有粒径小、表面积大等特点，广泛应用于生物、农业、环境等多个研究领域。研究表明，用ZnO NPs 喷施叶面，浸泡种子可促进植物生长［12］。例如，ZnO NPs 能够促进花生（Arachis hypogaea）、绿豆（Vigna radiata）和番茄（Lycopersicon esculentum）等植物幼苗根毛伸长，增加其生物量［12-13］。干旱胁迫下，100 mg·L-1的ZnO NPs 既能增强玉米水分利用效率和光合碳同化水平，维持植株正常生理代谢水平；又可以诱导内源褪黑素代谢途径，激活抗氧化系统，提高玉米抗旱性［14］。植物内生真菌是寄生在健康植物组织和器官内部的真菌或细菌，它们通过维持离子平衡、提高植物渗透调节能力、植物光合作用和水分利用效率、植物抗氧化的能力以及产生相应的次生代谢产物提高植物抗逆性［15-16］。例如，赵敏等［17］发现粘盖牛肝菌（Suillus bovinus）通过提高樟子松（Pinus sylvestrisvar.mongolica）抗氧化酶活性，降低丙二醛含量进而提高其耐旱性。李虹谕等［18］用菌根真菌处理1 年生水曲柳实生苗时发现水曲柳叶片的光合速率、蒸腾速率、气孔导度均高于对照，接种菌根真菌后影响了叶片结构并提高了叶片光合能力。由以上可知，水杨酸、纳米氧化锌和内生真菌在影响植物抗逆性方面有巨大的潜力。

研究表明，水曲柳雌雄异株，且遗传转化体系尚不完善，因此通过遗传手段培育耐旱的水曲柳品种十分困难。外源调节物质提高作物抗旱性已有报道［6-9］，但在林木抗逆方面应用较少，关于外源物质调节水曲柳抗旱性研究也尚不多见。因此探寻不同外源物质对林木抗逆性的影响具有重要意义。本研究以2 年生水曲柳幼苗为材料，从非生物和生物角度选择了3 种诱导剂，结合成本及大面积施用的可行性，探究外源施加50 mg·L-1SA、100 mg·L-1ZnO NPs 和实验室前期筛选的促生真菌YZ13-1 对其抗旱性的调控作用，为提高东北干旱区水曲柳幼苗成活率提供有效的解决方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料

选用东北林业大学帽儿山实验林场长势良好的2年生水曲柳实生苗，东北林业大学生命科学学院细胞生物学实验室前期筛选的促生内生真菌YZ13-1。

1.1.2 试剂与仪器

试剂：粒径为15 nm 的ZnO、水杨酸、磷酸氢二钠、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、核黄素、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑蓝、乙二胺四乙酸、过氧化氢、愈创木酚、硝基水杨酸、蒽酮、浓硫酸、脯氨酸、茚三酮、冰醋酸、抗坏血酸和土豆培养基等，所有化学试剂均为分析纯。

仪器：恒温水浴锅（HH-6，常州）、低温离心机（Micro17/Micro17R，美国），多功能酶标仪（Super-Max3100，哈尔滨）、电导率仪（雷磁DDSJ-08A，上海）等。

1.2 试验方法

2021年4月10日在东北林业大学生命学院盆栽试验场开展试验，采用盆栽法，选用口径24 cm，高19.5 cm，底径16 cm 的塑料盆，每盆装入6 L 土（V（黑土）∶V（沙）=3∶1），每盆定苗1 株，等量浇水。促生内生真菌YZ13-1 接种于土豆固体培养基，25 ℃黑暗培养1 周后，用棉棒将菌丝刮入试管中，无菌水冲洗菌板数次后，将菌丝团打碎配制成浓度为105cfu·mL-1的菌悬液。

2021年8月4日开始定量浇水，8月9日筛选生长状态一致的水曲柳，设置5种处理（见表1），各处理重复3株，用诱导子溶液对每株苗地上部分喷施40 mL，同时用60 mL 进行灌根处理。不同处理后的第1、2、3、6、11天取同一部位的展开叶片测定抗逆酶活性，第4、7、10天测定渗透物质含量，第7、30天取样，测定黄酮和多酚含量，每次3株，3次重复。测定抗逆酶活性和渗透物质的材料选用每株幼苗从上往下数第3～5 叶位成熟叶片，黄酮和多酚含量测定选用65 ℃烘干至恒质量的根和茎皮粉末。

表1 实验处理及对应编号Table 1 Experimental processing and numbering

1.3 测定方法

1.3.1 抗氧化酶测定

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定分别以氮蓝四唑光还原法、愈创木酚显色法以及紫外分光光度吸收法进行，具体方法参考郑金龙等［19］。

1.3.2 叶片相对电导率及抗逆物质含量测定

叶片电导率：利用电导率仪进行细胞膜透性电导率测定。

可溶糖（SS）含量、丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（PRO）含量测定分别采用蒽酮法、硫代巴比妥酸加热法和酸性茚三酮显色法，具体方法参考赵英力等［20］。

黄酮含量测定：水曲柳的根、茎皮，65 ℃恒温烘干，测定黄酮含量，检测方法见李可鑫等［21］。

多酚含量测定：准确称取样品0.1 g 于10 mL离心管中，加入3.5 mL 60%乙醇，70 ℃水浴提取1 h 后超声1 h，重复2 次，过滤，合并滤液，将滤液离心（10 000 r·min-1，5 min）。准确吸取0.1 mL 的上清液，加入10% FoLin-phenol 试剂0.5 mL，然后加入7.5%饱和碳酸钠溶液1.4 mL，再次混匀后，在避光室温（25 ℃）条件下反应30 min，测定760 nm处吸光度。

1.4 数据分析

利用Microsoft Excel 2019 和SPSS 21.0 软件进行数据分析、显著性检验和相关性分析，利用Graphpad prism 8软件作图。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下3种诱导子处理对水曲柳抗逆酶活性及电导率的影响

干旱胁迫下，不同诱导子处理对水曲柳抗逆酶活性的影响如图1A 所示，除T3 组外，其他组的SOD 活性均呈先升高再降低的单峰变化规律。T2和T3 组的SOD 活性在胁迫处理的3～11 d 降低，T1组在胁迫处理的3～7 d 呈现稳定状态，但在7～11 d呈下降趋势，T4组在胁迫后的1～7 d内升高，7～11 d降低。T1 组的CAT 活性均呈现下降趋势（见图1B），胁迫处理的第2、6、11天，T2组的CAT活性显著高于其他组，分别为T1 组的2.44 倍、2.35 倍、2.32 倍，在处理后的2、6 d，T4 组的CAT 活性高于T1 组，分别提高了72%、67%。CK、T2、T3 组的POD 活性均呈现先升高后降低再升高的变化规律，而T4 组的POD 活性是先降低再升高的变化趋势，T2 和T4 组的POD 活性显著提高，胁迫处理后第1 和2 天的比T1 组提高了1.79 倍、2.48 倍（见图1C）。3～6 d，3 种诱导子处理均能提高APX 活性，在第6 天，T2 和T4 组的APX 活性分别提高7.00 倍和3.03 倍（见图1D）。外源施加诱导子能使PAL活性升高，胁迫处理后第11 天，T2 组PAL 活性是T1组的1.20倍；胁迫处理后第3天，T4组的PAL活性是T1组的1.42倍（见图1E）。

T2 和T4 组的叶片相对电导率低于T1 组（见图1F），胁迫处理后第1 天，T2 和T4 组的叶片相对电导率分别比T1组降低了14%和34%，第11天分别降低了22%和27%；胁迫处理后的1～5 d，T3 组的叶片相对电导率低于T1组。

图1 不同诱导处理对水曲柳抵御干旱过程中抗逆酶及电导率的影响Fig.1 Effects of different treatments on anti-stress enzymes and electrical conductivity duringdrought resistance of F.mandshurica

上述结果表明，干旱胁迫下外源施加3种诱导子均能够提高水曲柳抗氧化酶活性，其中T2 处理，显著地提高了水曲柳幼苗叶片中POD、CAT、PAL 和APX 活性（P＜0.05），可帮助植物维持干旱胁迫下ROS的平衡，稳定电导率，减少对细胞结构的伤害，增强水曲柳耐旱性。另外发现，T4处理对SOD、CAT、POD 这3 种酶活性提高有促进作用，而T3处理对水曲柳抗逆酶的活性的影响较小。

2.2 干旱胁迫下3种诱导子处理对水曲柳抗逆物质含量的影响

干旱胁迫下，如图2A 所示，胁迫处理后第4天，与T1 组相比，T2 和T3 组脯氨酸的质量分数分别提高76%和239%（P＜0.05），但T4 组降低17%；胁迫处理后第7 天，T2、T3、T4 组的脯氨酸质量分数分别较T1 组提高52%、37%和103%（P＜0.05）；第10天，分别提高1.3倍、1.5倍、1.1倍（P＜0.05）。

如图2B所示，胁迫处理后第4天，与T1组相比，T4组的可溶性糖质量浓度变化显著，降低了38%。在胁迫处理后第7天，T2、T3、T4处理组较T1组分别提高了41%、21%、8%（P＜0.05），第10天，所有处理组均显著增加，T2、T3、T4组比T1组分别提高95%、22%和39%（P＜0.05）。如图2C所示，胁迫处理后第4天，T3、T4组的丙二醛的质量摩尔浓度显著降低，较T1组分别降低59%、62%（P＜0.05）；胁迫第10天，与T1组相比，T4组降低25%（P＜0.05）。

图2 不同诱导处理对抗逆物质含量影响不同小写字母表示同一时间下不同处理差异达到显著性水平（P＜0.05）；下同Fig.2 Effects of different induction treatments on osmotic material contentdifferent lowercase letters indicate that the difference between different treatments at the same time reaches the significance level（P＜0.05）；the same below

上述结果表明，干旱胁迫下施加3种外源诱导子能诱导水曲柳叶片可溶性糖和脯氨酸含量增加，同时降低丙二醛含量，特别是在胁迫第7 和10天，T2、T3 和T4 处理均显著提高了防御物质脯氨酸和可溶性糖的增加，进而调节细胞渗透势提高水曲柳幼苗耐旱性。

2.3 干旱胁迫下3种诱导子处理对水曲柳黄酮和多酚含量的影响

干旱胁迫处理第7天，T3、T4处理组根部的黄酮含量显著低于T1处理组，较T1组分别降低了29%、39%，胁迫第30天，T2、T3、T4组根部的黄酮含量均明显低于T1组，分别降低了46%、33%、18%（图3A，P＜0.05）。胁迫第7天，T2、T3、T4组茎部的黄酮含量均明显低于T1，分别降低了8%、24%、14%，胁迫第30天，T2、T3、T4组茎部的黄酮含量均明显低于T1，分别降低了8%、11%、6%（见图3A，P＜0.05）。

干旱胁迫处理第7 天，与T1 相比，T2、T3 根部的多酚含量分别增加了32%、10%，T2、T3、T4组茎部多酚分别增加了17%、6%、9%（见图3B，P＜0.05）。胁迫处理第30 天，与T1 组相比，T2、T3、T4组根部多酚的含量分别降低8%、11%、12%，T2、T3组茎部的多酚含量变化不显著，但T4组降低12%。（见图3B，P＜0.05）。

图3 不同诱导处理的水曲柳的多酚和黄酮的质量分数Fig.3 Mass fractions of polyphenols and flavonoids of F.mandshurica with different induction treatments

结果显示，干旱胁迫下黄酮和多酚的含量均提高，干旱胁迫下外源SA 增加了多酚的含量，但黄酮含量有所减少。

3 讨论

干旱、低温、盐碱等非生物胁迫因子制约了林木生长发育，且林木生长周期长，抗逆机制极为复杂。长期以来，如何改良和提高林木对非生物胁迫的抗性一直是研究难题，通过遗传手段培育耐旱的林木十分困难，特别是没有建立完整遗传转化体系的珍贵林木，例如水曲柳。国内外研究显示，施加外源调节物质在提高植物抗逆性方面具有强大的潜力［6-9］。本试验从化学试剂（非生物）和生物诱导剂两个角度选择了能够显著提高植物抗旱性的诱导子，包括水杨酸、纳米氧化锌和植物内生真菌，探究3种外源诱导子对水曲柳苗期抗旱性的调控效应。

干旱胁迫下，植物活性氧（ROS）积累、生理代谢紊乱和生长受抑。活性氧水平急剧增加会对细胞结构造成严重损害，而植物在长期进化过程中衍生出由酶（SOD、POD、APX、CAT 等抗氧化酶）以及非酶成分（谷胱甘肽、抗坏血酸、类胡萝卜素、生育酚和多酚等抗氧化剂）组成的抗氧化防御系统，它们相互协作抵抗活性氧对植物的氧化损伤［22］。本研究结果表明，干旱胁迫20 d 后的水曲柳表现出明显的缺水性状，如叶片萎蔫、卷曲、下垂，叶尖和叶基出现焦枯。而喷施SA（T2）和内生真菌（T4）的植株叶片性状得到明显改善，说明SA 和内生真菌可以增强水曲柳对干旱的耐受性。干旱胁迫下T2 组的抗氧化酶活性显著提高，其中CAT、POD 及APX 活性均比干旱处理（T1）的植株提高2倍以上，第6 天，APX 活性较T1 提高8.00 倍（P＜0.05）。抗氧化酶活性提高帮助植物清除体内过多的超氧自由基、降低膜脂过氧化作用，进而提高苗木适应胁迫的能力，本研究与前人［23-25］一致。

植物遭受胁迫时能产生渗透保护剂，这些渗透保护剂（如脯氨酸、甘氨酸-甜菜碱、甘露醇、山梨糖醇等）具有无毒、体积小等优点，可以通过不同的方式保护植物免受胁迫损害［22］。本研究表明，SA 喷施和灌根处理能显著增加可溶性糖含量，而ZnO NPs 和内生真菌喷施和灌根处理可有效提高脯氨酸含量。胁迫处理后第7 天，T2、T3 组的可溶性糖含量比T1组分别提高41%、21%，处理第4 天，T2 的脯氨酸含量提高76%，T3 和T4 的丙二醛含量分别降低59%和62%（P＜0.05）。叶片相对电导率的大小和含量多少可以衡量胁迫对细胞膜的损伤程度和完整性，在逆境胁迫下，植物细胞膜的透性变大，活性氧含量增加，电导率升高［26］。本试验结果表明，干旱胁迫早期（前4 d），3种诱导子处理均能降低叶片相对电导率，T2 和T3 组叶片相对电导率在第1 和11 天较T1 组分别降低22%和27%。植物在响应非生物胁迫时，酚类化合物具有抗氧化功能，它们有助于消除活性氧、维持蛋白质稳定［27］。Qin 等［28］研究表明，FuPAL1转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）中木质素和水杨酸水平增加，总黄酮水平降低。本研究表明，干旱胁迫下，SA 处理可以提高PAL 的酶活性，增加多酚含量，而黄酮含量降低可能是合成了其他酚类物质，比如木质素或转移到叶中积累。

褪黑素信号在调节植物生长发育，增强胁迫耐受性等方面都发挥着重要作用，植物通过调节褪黑素的生物合成与代谢，快速积累褪黑素以抵御胁迫。ZnO NPs能够引发玉米内源褪黑素产生，帮助其抗旱性提高［14］。El-Badri 等［29］研究发现，盐胁迫下，用ZnO NPs浸泡欧洲油菜（Brassica napus）种子，能够提高幼苗的根长、根冠比、抗氧化酶活性，进而提高其耐盐性。另外也有研究指出，从小麦中分离得到的内生真菌能促进小麦生长，还能帮 助 小 麦 抵 御 干 旱 胁 迫［30］。Zhou 等［31］从 油 松（Pinus tabuliformis）中分离的内生真菌能够提高油松幼苗的脯氨酸含量和抗氧化酶活性，从而提高其耐旱性。本研究发现内生真菌和ZnO NPs 在降低叶片相对电导率和提高渗透物质方面发挥显著作用，但关于内生菌和ZnO NPs 对水曲柳耐旱性的影响机制仍需进一步探究。

本研究结果显示，在水曲柳苗期喷施50 mg·L-1SA、内生真菌和ZnO NPs 能不同程度提高水曲柳苗期的抗旱性，且SA 表现出更显著的促进作用，能有效地提高水曲柳的抗氧化酶活性，同时降低细胞膜脂过氧化，增加渗透物质和多酚的含量，从而提高抗旱性。然而，水曲柳抗旱性及其调控机制复杂，后续还需要从基因水平、表达调控、信号传导网络等多个方面进行深入探索和解析。本研究为水曲柳苗期抗旱剂的选择及其抗逆遗传改良提供了重要的参考依据。考虑到实际应用的生产成本和操作性，在水曲柳苗期可喷施SA，以诱导水曲柳幼苗抗逆基因表达、防御系统启动，进而提高水曲柳抗逆性和苗期移栽的成活率，对天然林的生态恢复和保护具有生态意义。