转BpGLK裂叶桦叶色及生长变异分析

曹 俐 杨蕴力 李天芳 姜 静*

（1.林木遗传育种国家重点实验室，东北林业大学，哈尔滨 150040；2.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨 150081）

Golden2-like（GLK）转录因子是GARP 转录因子超家族中的一员，1926 年GLK 转录因子首次在黄化玉米（Zea mays）植株中被发现并命名［1］。GLK 转录因子通常包含2 个保守结构域，即Myb-DNA 结构域（DBD）和C-末端的GCT box［2］。GLK在植物叶绿体的形成和发育中起着重要作用，并参与植物细胞分化、果实品质和叶片衰老等生物学进程以及各种防御过程（包括生物和非生物胁迫）［3-6］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtGLK1和AtGLK2基因冗余调控叶绿体的发育［7］；在番茄（Solanum lycopersicum）中，GLK过表达增强了叶绿体发育和果实光合作用相关基因的表达，这些变异导致成熟果实中碳水化合物和类胡萝卜素提高［8］。在玉米中，ZmGLK1被认为在C4 植物组织叶肉细胞叶绿体发育中发挥着重要作用［2］。赵峥畑等［9］在连翘（Forsythia suspensa）基因组中鉴定出44 个FsGLK基因，其中FsGLK19 可能是黄叶型连翘呈色及响应光照度的关键基因。在林木中，银中杨（Populus alba×P.berolinensis）PaGLK过表达株系叶片颜色较对照株系更深，叶绿素含量增加，净光合速率降低［10］。白桦（Betula platyphylla）BpGLK过表达株系叶绿素a/b 与野生型无显著差异，叶色表现为深绿色［11］。上述研究表明，GLK基因参与植物叶绿体的发育，是创制黄叶植物的首选基因。

彩叶植物是指在整个生长季节或生长季节的某一阶段全部或部分叶片较稳定地呈现非绿色的植物［12］，具有独特的观赏价值，可以丰富园林景观色彩，提高园林绿化景观效果，提升城市绿化建设品位［13］，能够符合人们对园林绿化审美的要求，被广泛应用于园林造景。常见的彩叶乔木树种有红叶李（Prunus cerasifera）、红枫（Acer palmatum‘Atropurpureum’）、金 叶 国 槐（Sophora japonica‘Jinye’）、金 叶 皂 荚（Gleditsia triacanthos‘sunburst’）、黄金香柳（Melaleuca bracteata）等。彩叶植物呈现的颜色主要取决于叶绿素类、类胡萝卜素类、类黄酮类这3 类色素的含量和比例。例如，金叶复叶槭（Acer negundo‘Aurea’）叶片颜色和叶片中的叶绿素、花色苷及类胡萝卜素含量呈现出时序变化［14］；金叶银杏（Ginkgo biloba）叶总黄酮的含量及黄酮合成的能力均高于雄株和雌株［15］。目前有关彩叶植物叶片呈现的生理特性的研究较多，大多数从色素与叶色参数［16］、可溶性糖、相关酶类的关系等进行研究，为研究彩叶植物的呈色机理、分子机制及选育优良品种、园林绿化配置提供理论基础。

裂叶桦（Betula pendula‘Dalecarlica’）是欧洲白桦的一个品种，树干洁白，枝条下垂，极具观赏价值，可以作为园林绿化树种［17］，由于其叶片多裂近年来成为科学研究的对象。作者所在研究团队前期采用农杆菌介导的茎段转化法获得8 个BpGLK基因抑制表达裂叶桦株系，其中5个株系叶片表现为黄绿色，3个株系表现为绿色［18］。为了了解转Bp-GLK基因裂叶桦在生长期内叶色的变异规律，以及叶片黄化后是否会对苗木的生长产生影响，试验以转BpGLK基因裂叶桦及野生型裂叶桦为材料，分析叶色参数和叶绿素含量的时序变化，探讨叶绿素含量的降低对植株株高生长的影响，为后期转基因裂叶桦在园林绿化中的推广应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料为2 年生转BpGLK裂叶桦（RE1～RE8），野生型裂叶桦WT，每个株系30 株，种植于东北林业大学白桦育种基地。

主要质粒载体以pFGC5941 载体构建抑制表达载体p35S：：GLK-RNAi，由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 转基因裂叶桦分子检测

为了检测外源基因GLK和抗性基因Bar是否稳定存在于转基因植株DNA 基因组中，选取参试株系新鲜叶片利用植物DNA 提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取叶片总DNA，以p35S：：GLK-RNAi 质粒为阳性对照，以无菌水和WT 株系为阴性对照，以pFGC5941_CIS_F 和pFGC5941_CIS_R 为正向引物，以pFGC5941_Anti_F和pFGC5941_Anti_R 为反向引物，Bar-F 和Bar-R（见表1）进行PCR 扩增。PCR 反应体系及程序参照杨蕴力［18］方法，反应结束后，利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

分别提取参试株系叶片总RNA，反转录为cDNA，将cDNA 稀释10 倍后作为定量qRT-PCR 的模板，以18S rRNA 为内参基因，以q-glk-F 和q-glk-R（见表2）作为引物进行qRT-PCR分析，反应体系及程序参考杨蕴力［18］方法。将得到的数据用2-ΔΔCt方法进行分析。

表2 qRT-PCR扩增引物序列Table 2 qRT-PCR primer sequence

1.2.2 叶色调查

选取长势相近的参试株系，每个株系调查10株，从2021年5月15日开始，每隔30 d采用分光色差仪（CR-400，日本）测定其L*值及b*值。

1.2.3 叶片叶绿素相对含量的测定

采用KONICA MINOLTA 便携式叶绿素测定仪（SPAD-502 PLUS，日本）测定转基因株系及对照株系功能叶（从顶芽数起的生长状态一致的第4叶）的叶绿素相对含量（SPAD 值）。2021 年5 月15日为第1 个测量日期，9 月15 日结束，每30 d 对参试株系进行测定，每个株系分别调查10株。

1.2.4 叶绿素含量测定

选取转基因株系及对照株系从顶芽数的第4片功能叶，每个株系选取3 个单株，将取的叶片样品剪成细丝称取0.200 0 g，放入装有25 mL浸提液（V（丙酮）∶V（无水乙醇）=2∶1）的三角瓶中，室温条件下暗处理24 h后，提取液分别于470、645、663 nm波长下测定吸光度，重复3次。叶绿素浓度按公式计算：

式中：A663、A645、A470分别为对应波长下的吸光值；Ca、Cb、Ca+b和Cx，c分别为叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素质量浓度（mg·L-1）；ω为色素质量分数（mg·g-1）；V为提取液总体积（mL）；mF为所取叶片鲜质量（g）［19］。

1.2.5 苗高生长测定

用塔尺测量参试株系苗高，2021年5月1日为第1 个测量日期，10 月1 日结束，每15 d 对参试株系进行测定，每个株系分别调查15株。

1.2.6 数据处理

利用MATLAB Compiler Runtime 8.3 对苗高的生长规律进行Logistic 方程拟合。采用SPSS 27.0统计分析数据，采用双因素方差分析不同株系的叶色参数及光合色素含量，当方差分析结果显著时，采用Duncan法进行多重比较。并利用Origin 2021作图。所有统计分析的显著性水平α=0.05。

2 结果与分析

2.1 转BpGLK裂叶桦的分子检测

分别以转BpGLK裂叶桦株系的叶片总DNA为模板进行PCR 检测，结果显示：8 个转基因株系均能检测到与阳性质粒大小一致的目的条带，而水对照和WT 中没有检测出条带（图1），说明GLK基因及Bar基因整合于转基因裂叶桦基因组中。

图1 BpGLK抑制表达转基因株系PCR扩增电泳图谱A.正向PCR 检测；B.反向PCR 检测；C.Bar 基因PCR 检测；M.DNA Maker DL2000；1.阳性对照；2.阴性对照（ddH2O）；3.WT 株系；4～11.转基因株系RE1～RE8Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR amplification of BpGLK suppressed expression transgenic linesA.PCR for forward fragment；B.PCR for reverse fragment；C.PCR for Bar；M.DNA Maker DL2000；1.Positive plasmid；2.Negative contro（lddH2O）；3.WT line；4-11.Transgenic lines RE1-RE8

qRT-PCR 检测结果显示：8个抑制表达株系中BpGLK基因表达量均显著低于WT 株系（图2），8个转基因株系均值较WT 株系下调64%。对各株系BpGLK基因相对表达量进一步分析，8个株系中BpGLK的表达水平不尽相同，叶色为黄绿色的RE1～RE5 株系的BpGLK相对表达量均值较WT 株系低80%，而叶色为绿色的RE6～RE8 株系均值仅较WT株系低43%。

图2 转基因植株BpGLK相对表达量不同小写字母表示同一时间下不同株系间相对表达量差异显著（P＜0.05）Fig.2 Relative expression levels of BpGLK in transgenic plantletsDifferent lowercase letters indicate significant difference in relative expression among different lines at the same time（P＜0.05）

2.2 转BpGLK裂叶桦的叶色变异分析

CIELab 表色系统中L*值是衡量叶色明暗程度的指标，L*值越大，叶片越亮，b*值表示叶片的蓝黄属性，+表示偏黄，-表示偏蓝［20］。对不同发育期各参试株系的叶色参数L*值分析结果表明，在8个转BpGLK裂叶桦株系中，RE1～RE5株系在4个测定时期都显著高于WT 株系及RE6～RE8 株系（P＜0.05），而RE6～RE8株系在5 月15日高于或显著高于WT株系，在6月15日低于或显著低于WT株系，在7 月15 日和9 月15 日与WT 株系间的差异未达到显著水平。各株系的L*值在6月15日达到最大，此时RE1～RE5株系的L*值均值较WT株系均值高9.39%、较RE6～RE8株系均值高15.09%（表3）。

4 个发育时期内测定的b*值结果显示：RE1～RE5 株系在4 个测定时期中b*值均显著高于WT 株系及RE6～RE8 株系（P＜0.05）（表3）。RE6～RE8 株系在5 月15 日、7 月15 日均高于WT 株系，但未达到显著水平，RE6 株系的b*值在6 月15 日低于WT 株系，RE7株系的b*值则在4 个时期均高于WT 株系，而RE8株系的b*值在6 月15日和9月15日2个时间点均低于或显著低于WT株系（表3）。

表3 参试株系叶片L*值、b*值时序变化Table 3 Temporal variation of L*value and b*value in tested lines

图3 参试株系的叶色Fig.3 Leaf color comparison of the tested lines

2.3 转BpGLK裂叶桦的叶绿素相对含量变异分析

对4个时期的叶绿素相对含量进行测定，结果表明，RE1～RE5株系的SPAD 均值在4个时期均低于或显著低于WT 株系，在9 月15 日时RE1～RE5株系的SPAD 均值较WT 株系低32.59%。在RE6～RE8 株系中，RE6 的SPAD 均值在前2 个时期均低于WT 株系，但未达到显著水平；RE7 株系的SPAD 均 值 在5 月15 日和7 月15 日高于WT 株系，在6 月15 日显著低于WT 株系；RE8 株系的SPAD均值仅在7月15日高于WT株系（表4）。

表4 参试株系叶绿素相对含量（SPAD值）时序变异Table 4 Temporal variation of relative chlorophyll content（SPAD）in the tested lines

2.4 转BpGLK裂叶桦的叶绿素含量测定

为了解BpGLK基因的低量表达对裂叶桦叶片光合色素含量产生怎样的影响，在6月、7月及9月中旬分别测定转基因株系及WT株系叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。结果表明，RE1～RE5株系的叶绿素a 含量、叶绿素b 含量及总叶绿素含量均显著低于WT 株系且低于RE6～8 株系（表5～6），但RE1～RE5株系的叶绿素a与b比值却显著高于WT 株 系 和RE6～RE8 株 系（表5）。7 月 中 旬，RE1～RE6的类胡萝卜素含量显著低于WT株系，而RE7～RE8却高于WT株系，在9月中旬，只有RE2株系的类胡萝卜素含量高于WT株系，RE6和RE8株系的类胡萝卜素含量显著低于其他株系（P＜0.05）（表6）。

表5 参试株系叶片叶绿素a、叶绿素b质量分数的比较Table 5 Comparison of Chlorophyll a and Chlorophyll b mass fractions in the leaves of the tested lines

表6 参试株系叶片总叶绿素、类胡萝卜素质量分数的比较Table 6 Comparison of total Chlorophyll and Carotenoids mass fractions in the leaves of the tested lines

2.5 转BpGLK裂叶桦生长变异分析

2.5.1 转基因裂叶桦苗高生长模型建立与拟合

转基因裂叶桦苗高测量从5月1日开始，至10月初封顶结束，测定时间为150 d。若2021 年1 月1 日起记为第1 天，则苗高开始测量的时间为第121 天（2021 年5 月1 日），测量结束时为第271 天。用4参数Logistic 方程式分别对参试株系苗高的平均值进行拟合，并绘制出生长曲线（图4）。各生长模型方程的拟合系数（R2）均高于0.98，说明生长曲线拟合效果较好，可以用于后续分析。

图4 转基因株系树高逻辑斯蒂拟合曲线Fig.4 Logistic fit curve of tree height of transgenic lines

由表7 可知，部分转基因株系与WT 株系的苗高生长（即停止生长后的实测值）差异显著（P＜0.05），RE4 和RE6 株系苗高生长显著高于WT 株系及其他转基因株系，转基因株系苗高均值高于WT 株系的5.16%，RE5～RE8 株系的苗高速生点处生长速度均高于WT 株系，其中RE8 株系的最高，为2.260 cm·d-1。

表7 转基因裂叶桦苗高的Logistic模型Table 7 Logistic model of seedling height in transgenic birch

2.5.2 转基因裂叶桦速生期生长参数变异

转基因裂叶桦苗高从5 月初开始生长，10 月初封顶，生长期约为150 d。转基因株系与WT 株系从开始到进入速生期以及速生期结束的时间基本一致。由表8 可以得出，转基因株系（除RE1 和RE3）在速生期内苗高的平均生长量（GR）均高于WT 株系，其均值较WT 株系高10.80%。RE5～RE8株系的苗高日生长量均值（GD）高于WT 株系，RE1～RE4 株系（RE3 除外）的速生持续时长长于WT 株系，RE4 株系的速生持续时间较长，因此转基因株系（RE3 除外）的封顶苗木实测值与WT 差异不显著或显著高于WT株系。

表8 参试株系速生期生长参数Table 8 Comparison of growth parameters of transgenic lines in the fast growth period

3 讨论

裂叶桦叶缘具有分裂明显的裂片，树干洁白，枝条下垂［21］，在园林绿化中极具应用推广价值。以其为受体获得的转基因裂叶桦，在2年生时叶色表现为黄绿色，可以满足园林绿化中对彩叶树种的需求。GLK 转录因子是植物特有的一类转录因子，目前的研究已经证实了该转录因子在叶绿体发育、果实品质、生物及非生物胁迫、植物衰老和激素等方面都有作用。GLK基因在拟南芥和苔藓中表现出基因冗余，在拟南芥中，GLK基因能够调控长角果果色和叶片发育，并且该基因过表达可以影响拟南芥根部叶绿体的发育［22-23］，ZmGLK1和ZmG2基因过表达水稻在田间条件下叶绿素、叶黄素含量及光合作用相关的蛋白复合体等均明显提高［24］，水稻中GLKs可以与光合相关基因的启动子结合，进而上调光合基因的表达，促进叶绿体的发育，提高水稻的光合作用和产量［25］。本试验中裂叶桦BpGLK抑制表达，叶色为黄绿色的RE1～RE5株系在生长期内叶片亮度L*值和叶片黄色程度的b*值均显著高于WT 株系。叶绿体是植物进行光合作用的重要场所，植物体内的物质代谢和能量代谢主要依靠光合作用来完成，只有进行光合作用的植物才能生长发育［26］。叶绿素是植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，叶绿素含量作为叶片重要的功能性状，对植物的固碳和释氧能力有显著影响［27］。但叶绿素的合成受到多种酶和多个基因的调控，在水稻低叶绿素含量突变体中虽然叶绿素含量降低，但叶绿体的发育未受到影响，在高光强下，突变体没有受到光抑制，光反应电子传递未受到影响［28］，净光合速率高于野生型［29］，谷子黄叶突变体光合色素含量下降，但在强光下光合速率明显增加，气孔导度、光能利用效率和转化效率显著增加，其产量相关性状也显著提高［30］。以上研究表明，适当降低叶绿素含量，不仅有利于减少光抑制，而且还有利于氮素在光合系统内的分配，从而提高光合氮素利用效率［31-32］。GLK基因缺失及抑制表达可以使植物叶片变现出黄化现象，并在大田中稳定表现［10-11，33］。本试验中，BpGLK抑制表达获得的8 个转基因株系中，RE1～RE5 株系的叶绿素相对含量，叶绿素a，叶绿素b 及总叶绿素含量均低于或显著低于WT株系，并且在生长封顶后，这些株系苗高均与WT株系差异不显著或显著高于WT株系（RE3株系除外），表明BpGLK抑制表达，对植物的生长不会产生不利影响，这与刘佳琦等［34］对转BpGLK白桦的调查结果一致。因此，GLK基因可以作为选育黄叶树种的候选基因，获得的黄色树种可以为园林绿化提供黄叶树木资源。

4 结论

2 年生的转BpGLK裂叶桦外源基因稳定存在且GLK基因下调表达，同时，BpGLK基因抑制表达，并未影响裂叶桦株高生长，其中RE4株系停止生长时的苗高显著高于WT株系，且叶色能够稳定表现为黄绿色，后期可以作为园林造景的优选树种。