白藜芦醇通过Ca2+/Caspase-3 途径减轻内质网应激诱导的神经细胞凋亡

成秀梅，杨 雅，魏楚蓉，高红英，肖 凤，李梦军，杨留才*

1江苏医药职业学院基础医学部，江苏 盐城 224005；2井冈山大学医学部神经退行性疾病和衰老研究中心，江西 吉安 343009

内质网是细胞内蛋白质合成、折叠、组装以及钙离子（Ca2+）储存的主要场所，内质网中大量未折叠或错误折叠的蛋白质会导致内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），ERS是导致细胞凋亡的一个重要机制。研究显示，ERS 诱导剂毒胡萝卜素（thapsigargin，TG）可引起PC12细胞凋亡［1］。内质网是储存Ca2+并维持细胞钙平衡的重要器官，ERS可使胞浆钙失衡，引起钙超载，是细胞凋亡的重要病理生理因素［2］。钙超载可损伤线粒体功能，释放细胞色素C，从而激活Caspase-3、磷脂酶、蛋白酶和内切酶，引起细胞凋亡［3］。

白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种存在于葡萄皮和葡萄酒中的非黄酮类多酚有机化合物，具有抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移［4］、抗炎抗凋亡［5］等作用。众多研究报道，RES可通过抗氧化、抗炎对蛛网膜下腔出血发挥神经保护作用［6］；通过调节线粒体动态平衡减轻脑缺血再灌注损伤［7］；能够以浓度依赖性方式逆转H2O2诱导的Caspase-3表达增加、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生以及线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）的降低，从而保护视网膜神经节细胞免受H2O2诱导的凋亡［8］；可通过抑制1-甲基-4-苯基吡啶诱导的小鼠海马神经元内ROS升高和钙超载，降低Caspase-3表达和凋亡，表明RES可抑制氧化应激发挥神经保护作用［9］。另外，RES 可抑制乙醇诱导的内质网特征蛋白GRP78 的过表达，表明RES 可抑制ERS［10］。然而，RES 能否通过抑制ERS 诱导的钙超载，阻止Caspase-3 的激活，从而减轻神经细胞凋亡，目前仍未阐明。

1 材料和方法

1.1 材料

TG、BAPTA/AM（Sigma 公司，美国）；Fluo-3/AM和胰蛋白酶（Invitrogen 公司，美国）；DMEM 和FBS购自GIBCO 公司；β-actin、GRP78 和一抗（Abcam 公司，美国）；离子霉素（ionomycin），CCK-8和碘化丙啶（南京碧云天）；PC12细胞来自中国科学院培养物保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理

PC12细胞采用含有10%FBS，100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基于37 ℃95%空气和5%CO2混合气体中进行传代培养，构建ERS细胞模型［1］，即RES 预处理PC12 细胞24 h 后，用ERS诱导剂（TG，400 nmol/L）处理PC12细胞24 h。

1.2.2 免疫印迹

采用蛋白质定量试剂盒（BCA 法）测定蛋白质浓度，通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并将其转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉溶液封闭后，将膜分别与一抗［GRP78（1∶500），β-actin（1∶1 000）］于4 ℃杂交过夜，然后用TBST洗涤2 次，每次15 min，并在室温下与HRP标记的二抗（1∶3 000）孵育1 h，用TBST 洗涤2 次，ECL 显色，使用Bio-Rad成像系统检测蛋白条带。

1.2.3 胞浆Ca2+浓度测定

采用Fluo-3/AM和共聚焦系统测定细胞内游离Ca2+（intracellular free Ca2+，［Ca2+］i）浓度。处理后，将PC12细胞与3 μmol/L Fluo-3/AM孵育50 min，然后用EBSS 洗涤3 次，随机选择3 个视野采用激光共聚焦显微镜拍摄，运用LAS AF 2.5.1.6757 软件分析荧光强度，荧光的强弱表示［Ca2+］i的高低。

1.2.4 Caspase-3活性的测定

PC12 细胞处理后，采用比色法测定Caspase-3的活性［11］。将30 μL 细胞裂解液加入含60 μL 缓冲液的96 孔板中，再将10 μL Caspase-3 催化底物Ac-DEVD-pNA（终浓度为200 μmol/L）。反应混合物37 ℃孵育90 min，并在405 nm处读取吸光度值表示Caspase-3的活性。

1.2.5 凋亡率的检测

采用流式细胞术检测PC12 细胞凋亡率［12］。处理结束后，细胞（1×106）用pH7.4 的PBS 洗涤2 次，2 000 r/min离心5 min。然后将细胞重悬于pH7.4的结合缓冲液中，该缓冲液含有140 mmol/L NaCl、10 mmol/L HEPES和2.5 mmol/L CaCl2，另含50 μg/mL碘化丙啶，常温避光孵育30 min，上机检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 RES抑制TG诱导的ERS

为了评估RES对ERS的影响，采用12.5 μmol/L、25.0 μmol/L RES 预处理PC12 细胞24 h 后，再用400 nmol/L TG 处理24 h。采用免疫印迹检测GRP78 蛋白的表达以反映ERS 情况（图1）。TG 处理使PC12 细胞GRP78 蛋白表达升高到对照组的（2.36±0.14）倍（P＜0.01），25.0 μmol/L RES 预处理组GRP78 表达为对照组的（1.49 ± 0.58）倍（P＜0.05），明显低于TG处理组（P＜0.05）。上述结果表明，TG可诱导ERS，25.0 μmol/L RES抑制TG诱导的ERS。

图1 RES抑制ERS诱导PC12细胞GRP 78的过度表达Figure 1 RES inhibited GRP 78 overexpression induced by ERS in PC12 cells

2.2 RES阻止ERS诱导PC12细胞钙超载

为了探讨RES 对ERS 诱导［Ca2+］i变化的影响，用Ca2+荧光探针Fluo-3 和共聚焦系统检测PC12 细胞Fluo-3 荧光值以表示［Ca2+］i（图2）。为评估此系统能否检测出［Ca2+］i的变化，采用离子霉素（一种Ca2+载体）作为阳性对照，结果显示离子霉素处理后，PC12 细胞［Ca2+］i显著升高，表明采用的系统能检测出［Ca2+］i的变化。400 nmol/L TG 处理24 h，PC12细胞Fluo-3荧光值由对照组的48.8 ± 5.8 上升至105.6 ± 10.3（P＜0.01），而25.0 μmol/L RES 预处理后，PC12细胞Fluo-3荧光值为74.2±7.2，显著低于TG 组（P＜0.01）。上述结果表明，ERS 引起PC12细胞［Ca2+］i升高，而RES抑制ERS诱导的钙超载。

图2 RES对内质网应激诱导［Ca2+］i变化的影响（×630）Figure 2 The effects of RES on the change of［Ca2+］i induced by ERS（×630）

2.3 RES 对ERS 诱导Caspase-3 活化的影响以及钙超载在其中的作用

如图3A 所示，TG 处理使PC12 细胞D（405 nm）由对照组的0.074±0.012 上升至0.199±0.072（P＜0.01），RES+TG、DEVD-CHO（阴性对照）+TG 组D（405 nm）分别为0.129 ± 0.024、0.085 ± 0.027，显著低于TG组（P＜0.01）。这些结果表明ERS可激活Caspase-3，而RES可以减轻ERS对Caspase-3的激活。

为明确钙超载在ERS诱导Caspase-3活性升高中的作用，在ERS处理之前采用BAPTA（一种Ca2+螯合剂）预处理PC12细胞30 min，结果发现D（405 nm）值由TG 组 的0.234 ± 0.043 降 至0.137 ± 0.029（P＜0.01），但仍高于对照组的0.067±0.018（P＜0.01，图3B）。结合前面的结果，提示RES 通过抑制ERS 诱导的钙超载减轻Caspase-3的激活。

图3 RES对ERS诱导Caspase-3活化的影响以及钙超载在内质网应激诱导Caspase-3激活中的作用Figure 3 Effects of RES on caspase-3 activity induced by ERS and the role of Ca2+overload in the ERS-induced caspase-3 activation

2.4 RES 对ERS 诱导神经细胞凋亡的影响及钙超载在其中的作用

为了研究RES 对ERS 诱导神经细胞凋亡的影响，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。TG 使PC12细胞凋亡率由对照组的（1.31 ± 2.23）%升高至（16.07±11.76）%（P＜0.01，n=7），而RES 预处理后PC12细胞的凋亡率下降至（8.65±6.25）%，与TG组相比明显降低（P＜0.05，n=7），说明RES 减轻ERS诱导PC12 细胞的凋亡。为进一步明确钙超载是否介导ERS 诱导的细胞凋亡，使用BAPTA 螯合Ca2+，阻止钙超载，结果发现PC12 细胞的凋亡率下降至（9.02± 7.15）%，明显低于TG 组（P＜0.05，n=7，图4），提示ERS 通过钙超载导致PC12 细胞凋亡。

图4 RES对内质网诱导神经细胞凋亡的影响以及钙超载在其中的作用Figure 4 Effects of RES on ERS-induced apoptosis and the role of Ca2+overload in the ERS-induced apoptosis

3 讨论

ERS 已被证明参与缺血性脑卒中［13］、糖尿病脑病［14］、阿尔兹海默症［15］等多种疾病引起的神经损伤，可通过触发多种促凋亡机制，对神经细胞产生有害作用，而靶向抑制ERS可有效改善实验性神经损伤［16］。

RES可通过抑制ERS发挥神经保护作用。研究发现，RES 可以减轻ERS 特征蛋白GRP78 基因表达，从而改善小鼠术后认知功能障碍［17］；也可以通过抑制ERS，减轻氧化损伤和神经炎症，发挥神经保护作用［18］；还可以显著降低实验大鼠神经元GRP78和凋亡蛋白的表达，改善ERS介导的神经元凋亡［19］。本研究为了探究RES 在ERS 诱导神经细胞凋亡中的影响及其机制，采用ERS诱导剂TG处理细胞，构建ERS模型，检测ERS特征蛋白GRP78蛋白的表达以明确ERS 模型是否构建成功。采用400 nmol/L TG处理PC12细胞24 h，GRP78表达明显升高，说明ERS 模型构建成功；采用12.5 μmol/L和25.0 μmol/L RES预处理，发现25.0 μmol/L RES明显抑制TG引起的GRP78高表达，结果表明RES抑制ERS，与文献报道一致。

Ca2+信号通路被认为在凋亡中起着重要作用。研究发现，高糖可诱导心房肌细胞ERS，并上调细胞内和线粒体Ca2+浓度［20］。内质网钙过度转移到线粒体是一种促凋亡信号，对细胞命运有重要影响［21］。ERS时内质网中的Ca2+不仅释放到细胞质中导致胞浆钙超载，还通过线粒体相关内质网膜Ca2+通道流入线粒体，损伤线粒体功能，从而引起细胞能量代谢障碍，导致细胞凋亡，而抑制钙超载可以减轻ERS诱导的细胞凋亡［22］。本研究采用共聚焦和钙荧光探针Fluo-3 检测［Ca2+］i，利用这一系统发现ERS 可引起钙超载，BAPTA 能阻止钙超载，抑制钙超载后细胞凋亡率也明显下降。上述研究表明钙超载介导了ERS 诱导的细胞凋亡，这提供了一个减轻ERS诱导凋亡性细胞损伤的可能方向。另外，Singh等［23］研究发现RES 可以抑制ERS 引起的钙超载。为探讨RES 对ERS 诱导［Ca2+］i变化的影响，本研究采用25.0 μmol/L RES 对TG 处理的PC12 细胞进行干预，结果ERS 引起的钙超载和细胞凋亡都被明显抑制，表明RES 可抑制ERS 诱导的钙超载和细胞凋亡。

在凋亡信号通路中Caspase-3 常常参与激活核酸内切酶的最后阶段，在DNA 片段化中起关键作用。Gong 等［24］研究发现，ERS 激活Caspase-3，诱导细胞凋亡。Gaballah等［25］在评估RES对帕金森大鼠影响的研究中发现，接受RES治疗可抑制ERS诱导Caspase-3活性的升高，发挥神经保护作用。本研究也观察到ERS引起Caspase-3活性升高，而RES逆转这一升高，与文献报道一致。另外，Chen 等［22］研究发现，ERS时内质网Ca2+释放，引起胞浆和线粒体钙超载，通过线粒体释放细胞色素C 和MMP 改变，激活Caspase-3，引起细胞凋亡。Xu 等［26］研究认为，刺梨黄酮类化合物通过调控Bcl-2（Ca2+）/Caspase-3/PARP-1 通路可以发挥抗凋亡作用。但RES 能否通过抑制ERS诱导Ca2+/Caspase-3信号通路的活化，从而减少神经细胞凋亡尚未明确。为此，本研究采用钙离子螯合剂BAPTA 预处理PC12 细胞，阻止钙超载。观察到ERS 诱导的Caspase-3 激活和细胞凋亡被明显抑制，说明RES可通过抑制ERS诱导的钙超载，减轻Caspase-3的激活和细胞凋亡。

综上所述，本研究证实RES抑制ERS诱导的钙超载、Caspase-3激活以及神经细胞凋亡，Ca2+螯合剂BAPTA 明显逆转ERS 诱导的Caspase-3 激活和神经细胞凋亡，表明RES可通过调控Ca2+/Caspase-3途径抑制ERS诱导的神经细胞凋亡，为RES在ERS所致神经损伤中的保护作用提供了理论依据。