辣椒褐腐病病原菌拮抗菌筛选及生防效果

赵春燕 安良聪 赵秋玲 孙中涛

（1.聊城市茌平区农业农村局 山东聊城 252100；2.山东农业大学生命科学学院 山东泰安 271000；3.聊城市茌平区信发集团 山东聊城 252100）

关键字：辣椒褐腐病；拮抗菌；贝莱斯芽孢杆菌；生物防治

辣椒现已成为是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一[1-2]。 辣椒褐腐病是辣椒生长过程中的一种重要病害，发病轻的地块减产10%，发病严重的地块减产30%。 褐腐病在辣椒整个生长期均可染病，导致植株枯萎、死亡，果实腐烂、干瘪[3]，该病主要危害花器和果实，发病症状表现为花器染病后变褐腐烂，果实染病变褐软烂[4]，严重影响干鲜椒的产量和商品性。

化学防治能够在短时间内控制作物病情， 但长期使用化学防治方法不仅污染环境， 也不利于人类健康。 生物防治具有环境污染小、安全性高等优点，同时植物不易产生抗药性，是很好的防治方法[5]，不仅能够有效控制病原菌， 减轻农作物所受病原菌的伤害[6]，最重要的是可以避免化学防治的众多弊端，因此作物病害生物防治成为重点研究方向[7-8]。 生防菌在生物防治技术中有着重要地位，芽孢杆菌、绿脓杆菌、假单胞菌等各种细菌、放线菌、真菌均可用于植物的病害防治。 国内外在利用生防菌对植物病害进行防治方面都取得了一定的进展。 例如，海洋芽孢杆菌发酵液对黄瓜灰霉病的盆栽防效为83.23%[9]；木霉菌在植物病害的生物防治中被广泛应用[10]。山东农业大学景芳等研制的木霉菌剂能够有效防治黄瓜菌核病、油菜根腐病等多种病害[11-12]，但关于辣椒褐腐病生防菌的研究较少。

试验中筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌是一种重要的生防资源，在生物制剂研制中被广泛应用，已被用于治疗多种作物的褐腐病。 例如，陈少先分离得到贝莱斯芽孢杆菌zk1 对鹰嘴桃腐败真菌胶孢炭疽菌和哈茨木霉的抑菌率分别为57.59%和83.16%[13]，贝莱斯芽孢杆菌HNt7 能治疗或预防梨果实腐烂病，防效在70.76%以上[14]。 本试验旨在筛选出辣椒褐腐病的拮抗菌，探索辣椒褐腐病的生物防治方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 试验中的辣椒褐腐病病原菌角担菌 （Ceratobasidium ramicola）BING-15、 胡萝卜软腐欧文氏菌（胡萝卜软腐变种）（E. carafavoratear，saro-Eoriora）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、 辣椒疫霉菌（Phytophthoracapsici）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）由山东农业大学生命科学学院实验室提供。

1.1.2 培养基配制及病原菌活化 PDA 培养基（马铃薯200 g/L、 葡萄糖20 g/L、 琼脂15～20 g/L、pH 7.0，121℃高压灭菌20 min）；NA 培养基 （牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、 琼脂15～20 g/L、 蒸馏水pH 7.0，121℃高压灭菌20 min）；高氏一号培养基（可溶性淀粉20 g/L、硝酸钾1 g/L、NaCl 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、Fe2（SO4）30.01 g/L、琼脂20 g/L、pH7.0、蒸馏水1 000 mL，121℃高压灭菌20 min）。

室内盆栽供试材料： 线辣椒幼苗， 品种为帝王336，由潍坊寿光鑫青种苗公司提供。 供试土壤为山东佐田氏生物科技有限公司实验田的土壤。

病原菌活化： 将病原菌BING-15 菌种接种到新的PDA 培养基上，在28 ℃的恒温培养箱内培养72 h。

1.2 拮抗菌的筛选

1.2.1 拮抗菌的分离 供试土壤采集地点采集于德州、东营、济南、泰山4 地（表1）。 去除表层带有杂质的土壤，采取5～10 cm 深处的土样约200 g。

表1 土样采集

1.2.2 拮抗菌的筛选 对拮抗菌的分离采用稀释平板法， 将采集的土样过筛处理， 称取10 g 土样放入盛有玻璃珠和90 mL 无菌水的三角瓶中， 在37℃、170 r/min 摇床下震荡30 min[15]。 将液体混合均匀后进行稀释，分别吸取10-4、10-5、10-6、10-7稀释液100 uL在PDA 平板、LB 平板、 高氏一号培养基平板上涂布均匀，PDA 平板、高氏一号培养基平板在28℃恒温箱培养46 h，LB 平板在37℃恒温箱培养12 h[16-17]，分离纯化不同种类的菌种，验证其是否有拮抗效果。

通过平板对峙法筛选拮抗菌。 辣椒褐腐病原菌活化后，将饼菌（5 mm）置于新PDA 平板中心[18]，培养12 h 后在距菌饼2 cm 处按十字方向放置4 块拮抗菌，在28℃下恒温培养72 h，测量拮抗菌株与病原菌形成抑菌圈的直径[19]，每组设3 个重复。

抑菌圈直径（D）=2×抑菌间隙宽度+拮抗菌菌落直径（d）

1.3 拮抗菌的鉴定

1.3.1 菌落及菌体形态观察 观察拮抗菌培养基的颜色及菌落是否光滑、透明度、形状、大小、是否产芽孢，并对其进行革兰氏染色。

1.3.2 生理生化分析 参照 《常见细菌系统鉴定手册》对拮抗菌进行革兰氏染色、柠檬酸盐试验、接触酶试验、甲基红试验、淀粉水解试验、芽孢染色、V-P试验、吲哚试验等测定生理生化指标。

1.3.3 16S rDNA 测序分析 把分离纯化的菌株落送至青岛睿博兴科生物技术有限公司进行16S rDNA测序，将测序结果在NCBI 网站中进行BLAST 比对，选择比对结果中同源性相近的不同菌种序列， 利用MEGA 5.5 软件构建系统发育树进行同源性分析[20]。

1.4 拮抗菌验证试验

拮抗菌接种在LB 液体培养基中28℃、170 r/min摇床震荡培养72 h 制成悬浮液；病原菌接种在PDA液体培养基中28℃、170 r/min 摇床震荡培养72 h 制成悬浮液。 一组施加病原菌悬浮液500 mL+无菌水500 mL， 另一组施加病原菌悬浮液500 mL +拮抗菌发酵液500 mL，在辣椒开花期进行试验，25 d 后将辣椒植株挖出，清洗干净，观察辣椒植株情况。

对采摘的新鲜辣椒叶片用75%酒精消毒后再用无菌水冲洗3 次擦干备用。 一组在无菌水中浸泡2 h后接种病原菌菌块，另一组在拮抗菌液中浸泡2 h 后接种病原菌菌块， 在28℃恒温箱培养3 d 期间保持叶面湿润。

1.5 数据处理

利用Excel 2013 进行数据处理， 采用Duncan’s法进行方差析（SPSS 22.0）。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的筛选鉴定

2.1.1 拮抗菌株的筛选结果 利用稀释平板法在采集的土样中分离纯化到细菌25 株和放线菌2 株，通过平板对峙试验筛选到8 株对辣椒褐腐病菌拮抗效果较好的菌株， 经测算其中JK-1 抑菌圈直径最大，表明菌株JK-1 拮抗效果最好（图1、表2）。

图1 不同菌株对辣椒褐腐病菌的拮抗作用

表2 8 株拮抗菌对辣椒褐腐病菌的抑菌能力

2.1.2 拮抗菌菌株鉴定 拮抗菌JK-1 在LB 培养基三区划线，在37℃下培养12 h，菌落直径为3～5 mm，呈圆形，表面中心呈透明状隆起，边缘干瘪；JK-1 菌株革兰氏染色呈阳性，菌体短杆状，芽孢为绿色、椭圆形， 在LB 平板上呈乳白色，PDA 平板上菌落呈橘黄色，用接种环挑起黏稠状物质（图2）。

图2 贝莱斯芽孢杆菌JK-1 形态特征

2.1.3 拮抗菌生理生化鉴定 根据 《伯杰细菌系统鉴定手册》、 菌株生理生化试验及菌落菌体形态观察， 初步判定该菌株为芽孢杆菌属 （Bacillusspp.），JK-1 菌株的生理生化特征见表3。

表3 菌株JK-1 的生理生化特征

2.1.4 拮抗菌菌株测序分析 测序得到的JK-1 菌株基因序列进行BLAST 分析， 使用MEGA 11.0 软件，结合16S rDNA 序列构建系统发育树，发现JK-1菌株与芽孢杆菌属聚集在一起（图3）， JK-1 菌株与贝莱斯芽孢杆菌有非常高的同源性。 通过JK-1 菌株菌落及菌体形态观察、 生理生化试验， 结合测序结果，鉴定菌株JK-1 为贝莱斯芽孢杆菌。

图3 基于16S rDNA 基因序列相似性构建的系统发育树

2.2 拮抗菌抗菌谱试验分析

为了研究JK-1 菌株的生防能力， 通过平板对峙试验测定了JK-1 菌株对角担菌、 胡萝卜软腐欧文氏菌（胡萝卜软腐变种）、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉菌、立枯丝核菌、腐皮镰刀菌菌丝的抑制情况， 结果显示， JK-1 菌株对6 种病原菌均有一定的抑制作用， 其中对角担菌、 尖孢镰刀菌和立枯丝核菌抑制效果较明显（表4、图4）。

图4 菌株JK-1 抗菌谱试验结果

表4 拮抗菌JK-1 对病原真菌的拮抗效果

2.3 拮抗菌防治效果

由图5 可知， 浸泡无菌水接种病原菌的叶片产生水浸状病斑，慢慢扩散到整个叶面，最后全叶变褐枯萎，经JK-1 发酵液浸泡叶片未发未发病或轻微染病， 浇灌拮抗菌的植株比浇灌清水的植株茎秆粗壮高大、根系发达，试验表明拮抗菌JK-1 对辣椒褐腐病有很好防治效果。

图5 拮抗菌JK-1 处理后辣椒褐腐病对辣椒根部和叶片的影响

3 讨论与结论

贝莱斯芽孢杆菌在自然界中广泛存在， 人们陆续从水、土壤、动物肠道、发酵食品等处分离得到该菌种[21]，贝莱斯芽孢杆菌是目前研究生防菌的热点之一，能够产生多种生物活性物质，具有良好的生物学功能，能防治植物真菌，在促进植物生长方面也具有重要作用。

通过稀释平板法、平板对峙法方法筛选拮抗菌，其中菌株JK-1 抑菌效果最好， 通过观察菌株菌落、生理特检验性，结合16S rDNA 测序和构建系统发育树鉴定JK-1 为贝莱斯芽孢杆菌，此菌株贝莱斯芽孢杆菌JK-1 菌株对辣椒褐腐病病原菌有明显抑制作用，且JK-1 菌株具有广谱抑菌活性，对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉菌、胡萝卜软腐欧式菌均有抑制效果。 综上所述，本研究在根际土壤筛选到的对辣椒褐腐病病原菌有显著拮抗作用的菌株JK-1 对辣椒褐腐病病原菌有较强的防治效果， 具有良好的应用发展前景和生防潜能， 这将为此生防菌剂的开发及应用提供重要依据。