蓝孔雀肠道菌群中整合子及其水平转移相关性

陶芬，张饶，廖琦，李芬仙，刘垒成，姜玉莎，苗睿，吴培福

（1.西南林业大学生命科学学院，昆明，650224；2.云南野生动物园，昆明，650225）

在过去的几十年里，抗生素广泛应用于畜牧业和养殖业的疾病预防、治疗与促进生长，随着经济和社会的进步，人们对抗生素的耐药性也越来越重视。细菌耐药性的传播在很大程度上是由水平基因转移引起的，耐药基因常通过某些遗传元件（如质粒、转座子）传递。整合子能够捕获并表达外源基因，可将耐药基因整合到移动元件中，在耐药基因的转移过程中发挥重要作用，是衡量耐药基因水平转移的一项重要指标。抗生素的使用对人和动物肠道微生物群的组成有很大影响，越来越多的学者［1−2］关注肠道微生物群这一天然的耐药基因库、水平基因转移枢纽［3］，为细菌耐药性的发展提供了一个良好的平台，故肠道菌群中整合子及基因盒携带情况的分析在水平基因转移中具有重大意义。

蓝孔雀（Pavo cristatus）是一种极具观赏性的鸟类，目前国内关于蓝孔雀疾病的研究主要集中在寄生虫方面，包括球虫病［4−5］、绦虫病、线虫病和组织滴虫病［6］，尚未见关于蓝孔雀整合子、基因盒的相关分析报道。动物园作为科普宣传基地，具有物种繁多、人员复杂和流动性大等特点，其细菌耐药性的防控对公共卫生安全具有重大意义。本研究以动物园蓝孔雀粪便为材料，提取菌群基因组DNA，检测临床分离株中常见整合子、基因盒的流行情况，并对其进行水平转移分析，以期为细菌耐药基因水平转移研究和蓝孔雀疾病防治提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

以昆明市2 个动物园的蓝孔雀粪便为研究样品，其中1～120 号采集于云南野生动物园（相应的基因盒编号为H1～H120），121～139 号采集于圆通山动物园，共计139 份样品。样品采集原则：（1）被采样蓝孔雀近期未使用抗生素。（2）在早晨清理蓝孔雀粪便前采集新鲜粪便，保证样品无明显的杂质污染。（3）尽量无菌采集，用高压灭菌的50 mL 离心管收集样品，1 个样品装1 个离心管。（4）原则上采集不同蓝孔雀个体粪便，但动物园蓝孔雀为散养模式，无法做到粪便与个体的统一定位，故采用分散样地采样法，即在蓝孔雀活动的不同区域内采集，在一定程度上避免同一个体重复采样。（5）采集成形的、代表蓝孔雀个体的粪便，不采集混合粪便。（6）样品采集后即时送回实验室，−20 ℃保存备用。在同一时间段采集2 个动物园的蓝孔雀粪便样品，在采样期间，由于圆通山动物园中游客量较大，导致蓝孔雀粪便被反复踩踏，且数量较少，遵循采样原则，仅采集到19 份样品。

1.2 宏基因组提取

参考已有研究方法［7−9］，采用蛋白酶K-CTAB-酚氯仿法提取样品中菌群宏基因组DNA。提取过程：用丙酮、PBS 缓冲液预处理样品，采用差速离心法去除样品中的杂质，吸取悬浮液，离心后收集沉淀，用蛋白酶K 和溶菌酶消化细菌，最后采用酚氯仿法纯化DNA。

1.3 整合子检测

引物参考Su等［10］研究，由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。总反应体系25.0 μL，其中上 游引物（10 μmol/L）1.0 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，Taq酶1.0 μL，10×TaqBuffer 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，牛血清白蛋白（BSA）0.1 μL，ddH2O 为15.4 μL。3 类整合子（I类、Ⅱ类和Ⅲ类，即intI1、intI2和intI3）反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，30 个循环；72 ℃终延伸6 min。Ⅰ类整合子基因盒扩增反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 个循环；72 ℃终延伸6 min。配置1%琼脂糖凝胶，吸取5 μL PCR 产物加入凝胶孔内，在电泳仪（120 V）上电泳30 min。观察PCR 产物大小，统计扩增结果。

表1 用于扩增3类整合子的引物Tab.1 The primers used in amplifying three types of integrons

1.4 PCR产物测序分析

根据扩增产物的大小，分别选取整合子及基因盒的PCR 产物，送往上海捷瑞生物工程有限公司测序，每类整合子各选取2 个样本PCR 产物。研究发现，Ⅱ类和Ⅲ类携带的基因盒较少，且有的基因盒较大，普通实验条件无法扩增，Ⅰ类整合子基因盒有多种不同大小的PCR 扩增片段，最小片段约为400 bp，最大片段约为2 900 bp，考虑到蛋白编码基因和耐药基因的平均大小，仅研究750 bp及以上的扩增片段，并对电泳中较亮的片段进行测序。小片段可能为空整合子，空整合子一般不携带耐药基因，但存在再次整合可移动耐药基因的可能性。

下载NCBI 数据库中的细菌基因组数据及其注释，比对所测序列和数据库细菌基因组，找出含95%以上相似性片段的细菌基因组，查看相似片段上、下游5 kb侧翼区序列，如有整合酶/重组酶、转座子等关键基因，则可认为该基因盒具有水平转移的可能性。

1.5 统计与分析

用Excel 2016 整理和统计数据，Chromas 软件查看测序结果。仔细比对上、下游引物，选取测序结果一致的序列片段，利用NCBI数据库中BLAST程序搜索分析测序片段的同源性，并用Excel 2016、AI 软件和R软件包进行相应的绘图分析。

2 结果

2.1 整合子流行特征

所有样品中，intI1、intI2和intI3检出率分别为86.33%、69.78%和11.51%。图1 展示了云南野生动物园和圆通山动物园样品中整合子流行分布特征，intI1和intI2具有相似的分布特征，而intI3在2个动物园间存在差异（圆通山动物园样品中未发现intI3）。

图1 3类整合子的分布特征Fig.1 The distribution patterns of three types of integrons

2.2 样品基因盒扩增特征

从样品中扩增出不同大小或类别的Ⅰ类整合子基因盒条带，考虑到基因平均大小，只统计750 bp以上的条带类型（其余小片段见表2）。扩增的条带共有18种，片段大小为750～2 900 bp。每个样品的扩增条带数共有7种类型（图2 左上角），共发现51种不同大小条带的组合模式（图2）。从样品来源看，云南野生动物园与圆通山动物园样品基因盒扩增模式无明显区别，即圆通山动物园样品组合模式分散于云南野生动物园的样品中，但2 条最大扩增条带 2 900 bp均来自圆通山动物园的样品中。

表2 Ⅰ类整合子小片段基因盒统计Tab.2 Statistics of integron Ⅰ small fragment gene cassettes

图2 样品基因盒的扩增模式Fig.2 The PCR patterns of sample integrons

2.3 Ⅰ类整合子基因盒测序结果

从Ⅰ类整合子基因盒的扩增结果中随机选取条带较亮且引物二聚体较少的样品（均为云南野生动物园），即7 个基因盒样品（H12、H16、H22、H26、H27、H56、H78）进行测序，其中H12和H22样品基因盒为aadA2基因，H16 和H56 样品基因盒为aadA1基因，H26 和H27 样品基因盒为dfrA27基因，H78 样品基因盒结构分析表明，该基因盒包含aadA2阅读框、移码突变的截短基因aac（6'）-Ib片段和arr阅读框，其中aadA2阅读框具有与H22一致结构。

在NCBI 数据库中，序列对比发现，各基因盒序列与肠杆菌科（Enterobacteraceae）的多种细菌质粒和染色体上序列片段有很高的同源性，如大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）等，这些菌株来自不同的动物宿主、国家与分离样品。部分基因盒相似序列具有共同的菌株来源，H12、H16 和H56 样品基因盒具有相似序列，H22 和H78、H26和H27具有相似序列（表3）。

表3 各基因盒的共同相似序列（NCBI比对）Tab.3 The common similarity sequence of each gene cassette（NCBI alignment）

2.4 基因盒水平转移相关性

虽然在基因盒测序结果中对序列相似性进行了BLAST 比对分析，并在一定程度上反映了样品基因盒在不同环境、菌种、宿主和国家的分布广泛性，即整合子基因盒会在不同环境、菌种、宿主和国家间发生传播，但上述分析结果只展示了部分情况，不能在所有菌门、属或种的水平上反映基因盒分布偏向性或水平转移宿主偏向性，也不能反映基因盒在不同宿主、环境和国家分布偏向性。耐药基因传播有垂直传播和水平传播，水平传播对人和动物的健康会造成巨大危害，故本研究从染色体基因组、质粒、噬菌体和微生物组角度来分析样品基因盒与水平转移的相关性。

2.4.1 基于染色体、质粒基因组的相关性

利用染色体、质粒基因组数据库进行相关分析，其中染色体基因组有95 175 个，质粒基因组有 34 678 个，经比对分析发现，与H16 和H56 基因盒（aadA1）、H12 和H22 基因盒（aadA2）相似性较高的序列片段主要源自变形菌门（Proteobacteria）（占绝大多数）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和放线菌门（Acti⁃nobacteria），但aadA1、aadA2水平转移主要发生在变形菌 门中；与H26 和H27基因盒（dfrA27）、H78（aadA2、aac（6'）-Ib、arr）相似性较高的序列片段主要源自变形菌门和放线菌门，且该基因水平转移主要发生在变形菌门的细菌间，也见于放线菌门的细菌间。由此可见，7个基因盒的水平转移主要发生在变形菌门的细菌中，且具有共同的菌株来源（图3），其中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏杆菌、肠沙门氏菌（Salmonella enterica）与所有基因盒间均存在水平转移相关性，说明了蓝孔雀肠道菌群中耐药基因主要由这几类细菌传播。

图3 基因盒与染色体、质粒基因组的水平转移相关性Fig.3 Correlation analysis of horizontal transfer of gene cassette in chromosome and plasmid genome

2.4.2 基于微生物、临床基因组的相关性

在整合微生物基因组数据库中记录有154 974个宏基因组数据，经比对分析发现，与环境和工程相关的环境中，共筛选到120 个宏基因组数据；临床基因组中，共筛选到192 株具有明显临床分离株标注特征的基因组数据。由表4 可知，即使是不同来源（环境、临床）的样品（基于NCBI 比对）均可进行耐药基因的传递，说明耐药基因的跨界传播；在不同宿主细菌中肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏杆菌、肠沙门氏菌和铜绿假单胞菌是各基因组中传递耐药性的主要细菌，充分说明了这些细菌在水平基因转移中的重要性。

表4 基于环境基因组与临床基因组的水平转移相关性Tab.4 Horizontal transfer correlation analysis based on environmental genome and clinical genome

2.4.3 基于噬菌体基因组的相关性

在NCBI 数据库中，病毒基因组共有11 545 个，其中涉及细菌的噬菌体基因组有4 183个。同上，下载病毒基因组数据，并与测序序列比对，但噬菌体基因组中没有与本研究序列相似的片段，说明基因盒基因的水平传播主要借助质粒、整合子和插入元件等可移动元件。

3 讨论

3.1 整合子及基因盒流行特征

本研 究中，intI1、intI2和intI3检出率 分别为86.33%、69.78% 和11.51%，均与各基因流行情况［11］保持一致，但又有所不同。冯涛［12］在狐源大肠杆菌分离株中得到的intI1和intI2检出率分别为62.77%和13.56%，intI3未检出；王东阳等［13］对貉源大肠杆菌整合子进行检测，发现intI1检出率为72.00%，intI2为9.33%，未检出intI3，而本研究中3类整合子基因检出率都较高。在大部分研究中，Ⅱ类整合子常携带dfrA1、sat2和aadA1，与Ⅰ类整合子相似；Ⅲ类整合子常携带β-内酰胺类和氨基糖苷类耐药基因，但该型整合子较为少见［14］。本试验中Ⅱ、Ⅲ类整合子都存在较高的检出率，一方面说明宏基因组DNA 中检出率高于单菌株，另一方面说明动物园中蓝孔雀种群存在较高耐药性及耐药基因转移可能性。

Ⅰ类整合子是广泛分布于临床和环境中的细菌遗传元件，尤其在革兰氏阴性菌中［15］，细菌的耐药谱主要受其影响［16−17］，故研究检测了其携带的基因盒。结果显示基因盒主要为氨基糖苷类和甲氧苄啶类耐药基因，这2 类基因盒常在分离株中被检测到［18］。Ⅰ类整合子基因盒组合形式有较高的多样性［19−20］，在本研究中主要表现为不同长度条带组合的多种谱型，组合形式共计51种，反应了蓝孔雀种群潜在多重耐药的复杂性。

3.2 样品基因盒结构特征及水平转移特性

本研究中，基因盒的测序分析发现7 个样品均携带与水平转移相关的基因，且具有完整的基因结构（两端保守区域及中间可变区），因此，这些基因盒具有水平转移的可能性。目前，有研究表征细菌中Ⅰ类整合子携带基因盒进行水平转移的过程，如阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、沙门氏菌和大肠埃希氏杆菌［11，21−22］，Yu等［11］研究中表征了Ⅰ类整合子携带不同类别的基因盒，并验证了其接合转移的能力，进一步说明了本研究中基因盒水平转移特性，且这些基因水平转移主要发生在变形菌门中，这与大多数研究结果保持一致，如Zhao等［23］研究显示CTX-M等位基因通过水平转移在临床大肠埃希氏杆菌和克雷伯氏菌中广泛传播，Zheng等［24］将临床分离株中具ESBL基因（blaOXA-48、blaNDM-1、blaKPC-2和blaSHV-1）的质粒成功转移到实验室大肠埃希氏杆菌中。

在不同基因组数据中，7个样品基因盒具有相似（>95%）的来源，包括宿主、菌种、分离株和国家，说明耐药基因水平转移的普遍性及全球性，这些片段均具备水平基因转移特征（具整合酶、完整的基因结构等），基因盒可在动物、人与环境之间传播，与霍玮［25］的研究结果保持一致，霍玮在动物园灵长类（Primates）动物活动区域与饲养员体内均发现了携带mcr-1基因的大肠埃希氏杆菌分离株（但未证实来源是饲养员还是环境）。另外，基因盒相似片段的来源覆盖世界各地，耐药基因水平转移具全球性［26］，基因盒主要通过质粒传播，耐药性转移具广泛性，其宿主细菌主要有肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏杆菌、肠沙门氏菌和铜绿假单胞菌等，这些细菌也是临床检测中出现最多的病原菌，表明这些细菌是耐药基因的重要来源。

3.3 肠道菌群中宏基因组DNA研究

试验通常通过培养的方法扩增单菌株中的耐药基因，然而约有80%肠道微生物是无法培养的。本研究方法与传统培养方法相比，具有更高的检测灵敏度，可检测到更多非活菌中的耐药基因，故直接采用PCR 检测，结果会比培养之后的检出率更高，这在本研究Ⅱ类、Ⅲ类整合子检出率上得到体现。

综上，Ⅰ类整合子流行性较高，携带有不同大小条带的基因盒，并具水平转移能力，动物肠道中有密集的微生物群，发生水平基因转移的可能性比预期还会更高，说明耐药基因传播的高风险性。此外，外界环境在耐药基因的发展和传播中起很大作用［27］，本研究中，与样品序列相似性高的来源也包括环境，环境是耐药基因的一个重要储存场所。