梯度乙醇沉淀工艺对灵芝多糖结构特征及生物活性的影响

陆建能　麦碧仪　刘义军　赵雨诗　陈云兰　林丽静　周大圣　张明

关键词：灵芝；乙醇；梯度沉淀；多糖；理化特性

中图分类号：S567.3.11 文献标识码：A

灵芝是我国重要的药食两用真菌，具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿等功效[1]。灵芝子实体中含有糖类、三萜类、甾醇类和氨基酸等成分，在免疫调节、降血脂和免疫性肝损伤等方面具有良好的临床疗效[2-3]，灵芝药效与灵芝多糖活性和含量密切相关，灵芝多糖成为衡量灵芝产品质量优劣的最重要指标之一[4]。

灵芝多糖（GLPs）的结构和分子量是影响其免疫调节、抗肿瘤和调血脂以及保护肝脏等生物活性的关键因素[5-7]。灵芝多糖的支链种类以及支链和主链间的比例会随提取方法的不同而有所变化[8]，灵芝多糖分子量也会随分离方法的不同而有所变化，从而影响灵芝多糖的生物活性[9]。醇法、膜法等分离技术是国内外实现不同分子链灵芝多糖的常见方法。CAI 等[10]利用级联膜技术从灵芝多糖分离出322.0、18.8、6.4 kDa 3 种呈β 构型的多糖，所有分级的GLPs 均可以延长老鼠的游泳时间，提高耐力和促进疲劳恢复，推断分子量在10 kDa 以上的GLPs 可能是潜在的抗疲劳药物。MA 等[11]采用超滤膜法从灵芝多糖中分离出GLP1（>10 kDa）、GLP2（8～10 kDa）、GLP3（2.5～8 kDa）和GLP4（<2.5 kDa）4 个灵芝多糖，GLP1和GLP2 具有更强的抗氧化和抗增殖活性，高分子量灵芝多糖成分具有更强的生物活性。KAN 等[12]从超微灵芝子实体粉中提取多糖，采用无水乙醇分级沉淀得到4 种不同乙醇浓度下的灵芝多糖，GLP80 的抗氧化活性最好，由于该方法获得的80%浓度下醇沉的灵芝多糖含有GLP40 和GLP60成分，并不能准确地表达乙醇浓度对灵芝多糖的分离效果，而关于乙醇逐级分离沉淀灵芝多糖的相关报道较少。为了揭示灵芝多糖在不同浓度乙醇中的分布规律，以及各浓度下分离的灵芝多糖理化特性等相关性质的差异，本研究采用乙醇逐级分离沉淀得到不同灵芝多糖组分，对其单糖组成、分子量分布等结构特征进行表征，并研究不同组分的体外抗氧化活性及对鼠李糖乳杆菌生长的影响，为灵芝多糖多样化产品的开发提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

灵芝由本实验室栽培，栽培方法参考LIU 等[13]的方法。D-甘露糖（D-Man）、L-鼠李糖（L-Rha）、D-葡萄糖（D-Glc）、D-半乳糖（D-Gal）、L-阿拉伯糖（ L-Ara ）、D- 岩藻糖（ D-Fuc ）、D- 木糖（D-Xyl）、D-果糖（D-Fru）标准品购自上海源叶生物科技有限公司。DPPH 自由基清除能力试剂盒（分光法）、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（分光法）、羟自由基清除能力试剂盒（分光法）购自北京艾普希隆生物科技有限公司。鼠李糖乳杆菌LGG 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture CollectionCenter， CGMCC）。

1.2 方法

1.2.1 灵芝多糖的提取 将灵芝切片粉碎，用灵芝粉末和无水乙醇以1∶15（m/V）的比例，加入圆底蒸馏瓶，在真空提取系统中50 ℃回流提取3 h，过滤，得滤渣（去除原料中的油脂、色素、低聚糖和小分子物质等），50 ℃烘干。取灵芝粉末1000 g，按料水比1∶15（m/V）加入蒸馏水，在90 ℃水浴锅中提取2 h，过滤，上清液浓缩至原液的1/3，5000 r/min 离心10 min 进一步除杂，得到灵芝多糖溶液。在灵芝多糖溶液中加入适量无水乙醇，调节溶液乙醇浓度为40%（V/V）时得到絮状沉淀，5000 r/min 离心10 min，收集沉淀，命名为GLP40；所得上清液继续加入适量无水乙醇，调节溶液乙醇浓度为50%（V/V）时得到絮状沉淀，5000 r/min 离心10 min，收集沉淀，命名为GLP50；按照上述方法，分别沉淀得到GLP60、GLP70、GLP80、GLP90；所得沉淀置于–40 ℃冷冻干燥机冻干48 h，然后置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法测定灵芝子实体中的多糖含量。以葡萄糖为标准品，配制0.1 mg/mL 的葡萄糖溶液。分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 葡萄糖溶液于15 mL 具塞玻璃试管中，加蒸馏水补至1 mL配成不同浓度的标准葡萄糖溶液，然后分别加入1.0 mL 6%苯酚溶液，快速加入5.0 mL 硫酸，振荡20 s 混匀，100 ℃水浴15 min，快速冷却至室温，在490 nm 处测定其吸光值（A）。根据不同浓度葡萄糖溶液（C）的吸光值建立标准曲线A=0.01×C+0.0017（R²=0.9994）。

多糖含量的测定：称取10 mg 各样品于10 mL离心管中，加3 mL 水溶解，振荡20 s 混匀，沸水浴2 h，冷却至室温，过0.45 μm 有机微孔滤膜至100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为测试液。按照上述步骤处理，在490 nm 处测定其吸光值，根据曲線计算多糖含量。

1.2.3 单糖组成分析 根据邓永智等[14-15]的方法分析灵芝多糖单糖组成，稍加改进。准确称取10 mg 多糖样品与2 mL 2 mol/L 三氟乙酸（TFA）在110 ℃烘箱中水解6 h，氮气吹干，加入同体积甲醇沸水浴蒸干，重复3 次。加入10 mg 盐酸羟胺和1 mL 吡啶，轻轻摇晃使其充分溶解，于90 ℃水浴锅中反应30 min，冷却至室温，加入1 mL 乙酸酐，90 ℃水浴30 min，氮气吹干，加入1 mL氯仿溶解，过0.45 μm 微孔滤膜，进行GC-MS 分析。另外以D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-岩藻糖、D-木糖、D-果糖等标准品经相同条件处理，进样。

气相色谱-质谱（GC-MS）分析条件。色谱柱：HP-5ms（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）毛细管柱；升温程序：初始柱温130 ℃，保持5 min 后，以2.5 ℃ /min 的升温速度升温至220 ℃ ， 再以10.0 ℃/min 升温至260 ℃，进样温度280 ℃；载气为99.99%高纯度氮气，柱流量为1.0 mL/min，分流比1∶50；进样量为1.0 μL。质谱（MS）条件：离子源温度230 ℃，接口温度260 ℃，扫描质量范围为30～450 m/z，溶剂延迟时间5.0 min。

1.2.4 近红外光谱测定 将1 mg/mL 多糖水溶液置于金镜表面上， 滴入一滴样品溶液， 置于Thermo Nicolet iN10 近红外分析仪（美国赛默飞）测量，整个测量过程采用液氮和氮气保护，每次样品测量之前使用相同参数采集清洁金镜表面的背景光谱（采集背景），扫描范围为4000～400 cm^–1，分辨率为4 cm^–1。

1.2.5 分子量分布测定 采用高效液相凝胶色谱仪（HPGPC）测定灵芝多糖分子量和纯度。将多糖样品以及5000、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800、667 800 Da 多糖标准品配制成5 mg/mL 标准品溶液，12 000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm 微孔滤膜过滤，移入1.8 mL 进样瓶中。溶液注入高效液相色谱仪（LC-10A， Shimadzu）串联凝胶柱中（BRT105-104-102， 8 mm×300 mm）建立保留时间（RT， min）与峰位分子量（Mp）、重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）的线性回归方程，其中检测器为示差检测器（RI-10A， Shimadzu），流動相为0.05 mol/LNaCl 溶液，柱温40 ℃，流速0.6 mL/min，进样量20 μL。分子量与保留时间的校正曲线为lgMp=–0.1799RT+11.556，R²=0.995；lgMw=–0.1917RT+12.108，R²=0.9934；lgMn=–0.1776X+11.392，R2=0.9905。

1.2.6 体外抗氧化活性测定 总抗氧化能力（T-AOC）的测定。采用FRAP 法测定，吸取75 μL125 μg/mL 灵芝多糖水溶液于1.5 mL 测定管中，依次加入75 μL 蒸馏水和850 μL 显色液（苏州格锐思生物科技有限公司FRAP 试剂盒试剂），振动混匀，置于室温反应10 min，在590 nm 处测其吸光值（A1），若吸光值>1.8，则采用蒸馏水稀释至一定的倍数（D）。蒸馏水作空白对照，按照上述步骤，在590 nm 处测其吸光值（A0）。多糖的总抗氧化能力（μmol/mL）=0.36×[（A1–A0）+0.0262）]×D。采用蒸馏水调零，重复3 次。

1.2.7 DPPH 自由基清除能力的测定 吸取400 μL 500 μg/mL 多糖溶液于1.5 mL 测定管中，然后加入600 μL 工作液（苏州格锐思生物科技有限公司FRAP 试剂盒试剂），振动混匀，置于室温避光反应30 min，4000 r/min 离心5 min，取上清液，在517 nm 处测其吸光值（A2），作为测定组。吸取400 μL 500 μg/mL 多糖溶液于1.5 mL 测定管中，加入600 μL 80%甲醇，振动混匀，按照上述步骤，在517 nm 处测其吸光值（A1），作为对照组。吸取400 μL 80%甲醇以及600 μL 工作液于测定管中，振动混匀，按照上述反应步骤，在517 nm 处测其吸光值（A0），作为空白组。多糖的DPPH 自由基清除率=[1–（A2–A1）/A0]×100%。采用无水乙醇调零，重复3 次。

1.2.8 羟自由基清除能力的测定 吸取125 μL试剂盒中的试剂1 于1.5 mL 测定管中，依次加入125 μL 试剂盒中的试剂2，625 μL 1000 μg/mL 灵芝多糖溶液，125 μL 试剂盒中的试剂3，振动混匀，置于37 ℃反应20 min，在517 nm 处测其吸光值（A₂），作为测定组。吸取125 μL 试剂1 于1.5 mL 测定管中，依次加入125 μL 试剂2，625 μL1000 μg/mL 灵芝多糖溶液，125 μL 蒸馏水，振动混匀，置于37 ℃反应20 min，在510 nm 处测其吸光值（A1），作为对照组。吸取125 μL 试剂1 于1.5 mL 测定管中，依次加入125 μL 试剂2，625 μL蒸馏水，125 μL 试剂3，振动混匀，置于37 ℃反应20 min，在510 nm 处测其吸光值（A₀），作为空白组。多糖的羟自由基清除率=[A₀–（A₂–A₁）]/A₀×100%。上述测试采用蒸馏水调零，所有测试重复3 次。

1.2.9 多糖对鼠李糖乳杆菌生长的影响 在无菌条件下，取鼠李糖乳杆菌LGG 200 μL 接种于MRS 肉汤培养基上，（37±1）℃厌氧培养12 h，进行菌种活化。在接种2%（体积分数）鼠李糖杆菌LGG 的MRS 液体培养基中添加灭菌1%多糖溶液，以添加去离子水为空白对照，在（37±1）℃培养20 h，从0 h 开始，每隔2 h 测定菌液OD600值，绘制鼠李糖乳杆菌的生长曲线。

1.3 数据处理

采用Excel 2013 软件对试验数据进行整理，利用Origin 8.0 软件作图，采用SPSS 22.0 软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 灵芝多糖中总糖和单糖含量分析

由图1 可知，不同浓度醇沉所得灵芝多糖颜色和外观形貌存在较大差异。由表1 可知，GLP70的总糖含量最高，GLP90 的总糖含量最低，说明70%乙醇浓度能将提取液中的大部分灵芝多糖沉淀下来，同时90%乙醇浓度有助于将灵芝提取液中的大部分杂质沉淀下来。不同浓度所得粗多糖中均含有6 种单糖，包括鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。根据这6 种单糖的摩尔比可知，不同多糖样本中的单糖占比存在较大差异，GLP40 主要由甘露糖和木糖组成，GLP50、GLP60、GLP70、GLP80 和GLP90 主要由葡萄糖和甘露糖组成，GLP80 和GLP90 的葡萄糖占比较高。

2.2 灵芝多糖近红外光谱分析

为了进一步确定不同浓度醇沉所得灵芝多糖的结构差异，分别对6 种多糖进行红外光谱分析（图2）。6 种多糖均在3311～3376 cm^–1之间具有较宽的吸收峰，为O-H 的伸缩振动，在2935 cm^–1附近具有弱吸收峰，为烷基的C-H 伸缩振动，在1618～1630 cm^–1处出现的较强的峰是C=O 伸缩振动，在1404～1411 cm^–1处出现的峰是-CH 的变角振动引起的，在1048～1084 cm^–1 附近出现的峰是常见的吡喃糖环内酯和羟基的吸收峰共振吸收峰，是由于糖环上C-O-C 醚键的不对称伸缩振动构成了糖类的特征吸收峰，也是葡聚糖典型的红外光谱信号[16]。此外892.9 cm^–1处是典型的吡喃葡聚糖和β-型糖苷键链接特征吸收峰[17]，说明6 种灵芝多糖均为β-型葡聚糖构型。同时930 cm^–1處的弱峰为端基碳C-H 弯曲振动峰[18]，GLP40 和GLP50 在930 cm^–1附近有特征吸收峰，而在890 cm^–1处较弱，说明60%及以上浓度醇沉所得的灵芝多糖主要为β-型葡聚糖构型，且官能团无明显差异。

2.3 灵芝多糖分子量分布规律分析

采用HPGPC 对不同乙醇浓度所得灵芝多糖的分子量和纯度进行测定。由图3 可知，不同乙醇浓度所得灵芝多糖的高效凝胶渗透色谱图有明显差异。利用峰位分子量（Mp）、峰重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）对不同乙醇浓度所得灵芝多糖的分子量等参数进行计算（表2）。由表2 可知，不同乙醇浓度所得粗多糖的分子量分布存在较大差异，重均分子量越大，其数均分子量与峰均分子量也越大。以重均分子量为例，GLP40 分子量分布在97～14 925 g/mol 之间，GLP50 分子量为99～49 410 g/mol，GLP60 分子量为98～32 030 g/mol，GLP70 分子量分布在3614～19 589 g/mol 之间，GLP80 分子量分布在3614～10 795 g/mol 之间，GLP90 分子量分布在4385～11 084 g/mol 之间。不同灵芝多糖组分中分子量占比也有差异，Mw>10 000 g/moL 中，GLP40、GLP50、GLP60、GLP70、GLP80、GLP90 分别占比55.038%、79.837%、86.355%、84.349%、70.818%和61.059%，且呈先增后降的趋势。

2.4 灵芝多糖体外抗氧化活性分析

不同乙醇浓度所得灵芝多糖体外抗氧化活性如图4 所示，不同浓度醇沉所得灵芝多糖均具有一定的DPPH 清除能力、羟基自由基清除能力及总抗氧化能力，且呈显著差异。显著性分析结果表明：GLP40、GLP50、GLP60、GLP80、GLP90两两间的DPPH 清除能力存在显著性差异，GLP70 与GLP50 的DPPH 清除能力差异不显著，与其他差异显著。GLP40、GLP50、GLP60、GLP80、GLP90 两两间的羟基自由基清除能力存在显著性差异，GLP70 与GLP90 的羟基自由基清除能力差异不显著，与其他差异显著。GLP40、GLP50、GLP60、GLP70、GLP90 两两间的总抗氧化能力存在显著性差异，GLP70 与GLP80 的总抗氧化能力差异不显著，与其他差异显著。其中，羟基自由基清除能力随着乙醇浓度的增加而增强，而DPPH 清除能力和总抗氧化能力无明显的变化规律，GLP90 的DPPH 清除能力、羟基自由基清除能力、总抗氧化能力均最大。

2.5 灵芝多糖对鼠李糖乳杆菌LGG 生长的影响

不同乙醇浓度所得灵芝多糖对鼠李糖乳杆菌LGG 的生长曲线如图5 所示。由图5 可知，与对照相比，灵芝多糖能促进鼠李糖乳杆菌LGG 的生长，且不同乙醇浓度沉淀所得多糖的促进作用有差异。GLP40 处理的初始刺激效果最强，4 h 以后快速进入对数生长期；而其他多糖处理在4 h之前比对照生长慢，但是4 h 之后快速超过对照，进入对数生长期，同时对数期比对照延迟2 h 以上。经过培养20 h，GLP40、GLP50、GLP60、GLP70、GLP80、GLP90 处理的生长曲线有多次重复交叉，可能源于不同灵芝多糖样品中含有刺激鼠李糖乳杆菌LGG 不同生长阶段的成分，但是还需进一步研究。

3 讨论

多糖是灵芝子实体中重要的功能性成分之一，多糖中单糖种类、分子量、官能团等影响着多糖的结构特征。灵芝子实体中多糖种类丰富，含岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸等单糖中的一种或几种，且以α-或β-糖苷键相连[19]，其中β 型多糖起主要的生物活性作用[20-21]。同一品种不同状态（发酵液、菌丝体和子实体）灵芝多糖的组成存在差异[22]，且不同提取方法的灵芝多糖结构和生物活性也存在差异，由于不同浓度乙醇对不同分子量的灵芝多糖具有不同的沉淀效果[23]，导致本研究中6 种多糖样本的单糖占比存在较大差异。KAN 等[12]研究表明，分级沉淀中各组分存在浓度的交叉性，比如GLP60 组分含有40%、50%、60%3 种浓度下沉淀的多糖成分，GLP60 中葡萄糖含量最高，由于沉淀方法的差异导致二者结果也有差异。官能团组成是灵芝多糖结构的另一个重要特征，本研究所得6 种灵芝多糖组分官能团组成无较大差异，与刘钧发等[24-25]的研究结果一致。由此可见，栽培方式、提取方法等因素对灵芝多糖结构官能团的影响较小。

灵芝多糖的体外抗氧化活性及其生物活性与多糖构型、分子量等结构特征紧密相关[26-27]。ZHEN 等[28]从树舌中分离纯化出灵芝均质多糖，其中分子量为6.82×10⁵Da 的多糖组分能显著抑制MCF-7 细胞的增殖。KAN 等[12]采用分级沉淀得到GLP40、GLP60 和GLP80 三种多糖组分，GLP80 的DPPH 清除能力、羟基自由基清除能力及总抗氧化能力最强，其次是GLP60 和GLP40，高浓度乙醇沉淀物的体外抗氧化活性较强，与本研究结果一致。可能由于DPPH 清除能力、羟基自由基清除能力及总抗氧化能力3 种检测方法的作用机理不同，且与KAN 等[12]的提取方法不同，从而导致本研究中6 种多糖组分的3 种体外抗氧化活性的变化规律不一致。CAI 等[10]采用级联膜技术分离得到3 种多糖组分，进行小鼠实验发现分子量在10 kDa 以上的多糖能延长游泳时间，提高耐力和促进疲劳恢复。本研究中乙醇浓度大于70%所得分子量在10 kDa 以上的多糖组分呈下降趋势，由此可以推断70%乙醇能将大部分灵芝功效成分分离出来。吴林秀[29]的研究结果表明，茶树菇多糖可以有效防止鼠李糖杆菌LGG 被活性氧抑制，并且提供碳源能促进鼠李糖杆菌生长，同时作为益生元能促进益生菌的增殖，从而更好地调节胃肠道功能。本研究结果表明，6 种灵芝多糖组分均有助于促进鼠李糖乳杆菌LGG 的生长，为灵芝多糖的产品开发提供基础数据支撑，但其作用效果存在一定差异，今后需进一步研究灵芝多糖刺激鼠李糖杆菌生长的作用机理。

本文研究了梯度乙醇沉淀工艺对灵芝多糖结构特征及生物活性的影响，结果表明：灵芝多糖主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，梯度乙醇沉淀工艺未改变6 个多糖组分中单糖种类组成和官能团组成，但影响了6 个多糖组分的各单糖含量、分子量分布、体外抗氧化活性等，灵芝多糖能促进鼠李糖乳杆菌LGG 的生长。本研究为灵芝多糖提取工艺研究及产品开发提供了基础数据支撑。