姬松茸粗多糖防治烟草花叶病毒病

胡叠　唐前君　罗坤　吴秋云　夏志兰　刘敏

关键词：姬松茸；粗多糖；烟草花叶病毒；半叶法

中图分类号：S435.72 文献标识码：A

烟草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）为单链正义RNA 病毒，经接种鉴定统计其寄主多达350 多种植物，除烟草外，还为害多种经济作物，例如茄科、十字花科等[1]。生产中病毒粒子的扩散和流行速度受温度、湿度、光照的影响，在高温和强光环境下病毒延长潜育期，一旦条件适宜再爆发病症。全国各烟区均有因烟草花叶病造成减产的问题，尤其是云南、贵州烟区主要受TMV 影响，平均发病率为20%～30%，严重年份高达60%～80%，导致毁田和绝收[2]。

天然真菌多糖主要分布在大型真菌子实体和菌丝中，多个单糖（10 个以上）以糖苷键连接组合成螺旋状高分子多聚物[3]，结构形态近似于DNA，具有特殊生物活性[4]。经过深入研究，研究人员发现一些真菌中含有多种农用活性物质[5]。真菌多糖在抑制病菌和病毒、杀线虫、防治害虫等方面有良好的效果，已经在香菇属（Lentinus）、蜡伞属（Hygrophorus）、杯伞属（Clitocybe）和牛肝菌（Boletus）等菌类中均有发现[6-8]。张超等[9-10]以平菇、香菇和金针菇子实体为材料，从中提取的多糖在枯斑寄主苋色藜上对TMV 表现出不等的抑制作用。许玉娟等[10]发现经苍耳多糖处理后的心叶烟，在接种TMV 后，枯斑明显少于对照组，有效抑制了TMV 浸染，推测苍耳多糖诱导植株防御酶活性从而抑制病毒。吴艳兵等[11]从体外钝化、预防、治疗三方面评价了毛头鬼伞多糖对TMV 的抑制效果，发现毛头鬼伞多糖具有较强的预防侵染作用，可有效预防TMV病毒病的发生。香菇多糖为现市面具代表性的真菌多糖农药产品，共登记44 个产品信息，以0.5%～2.0%水剂为主，具有杀菌和植物抗性诱导作用。赵新保[12]研究表明，0.5%香菇多糖水剂用量为18.75～26.25 g/hm² 时，辣椒病毒病防效可达62.0%～66.5%，并且该药剂在有效浓度范围内对作物和环境安全。

随着社会经济的快速发展以及生活水平的不断提高，食品安全意识也逐渐加强，因此农业生产中绿色防控技术的需求增加。真菌多糖是真菌的代谢产物，天然且安全，残留在环境中也会被微生物分解，不造成污染。真菌多糖可诱导植物提高抗病性、激发植物免疫力，可以开发成农业生产上新型的植物抗病诱导剂，具有非常好的应用前景。本研究在提取6 种真菌多糖粗品的基础上，采用半叶法和绿色荧光标记技术，筛选出抗TMV 效果最好的多糖，研究结果对作物TMV 的绿色防控具有一定的理论意义和实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病毒 烟草花叶病毒（Tobacco mosaicvirus， TMV），由湖南农业大学植物保护学院植物病理学系唐前君老师提供。

1.1.2 供试作物 心叶烟（Nicotiana glutinosa）、普通烟NC-89（N. tabacum var. NC89）、本氏烟（N. benthamiana）、云烟87（N. Yunyan 87），由湖南农业大学植物保护学院植物病理学系唐前君老师提供。

1.1.3 供试药剂 0.5%香菇多糖水剂，市购，山东圣鹏科技股份有限公司生产；1.8%辛菌胺醋酸盐水剂，市购，河南神华药业有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 烟草花叶病毒（TMV）悬浮液制备 取感染病毒的叶片（云烟87）样品100 g，剪碎置于研钵内，加入少许石英石和20 mL 预冷磷酸缓冲液（0.2 mmol/L， pH 5.7～8.0），充分研磨，过滤；磷酸缓冲液定容至100 mL，制得烟草花叶病毒悬浮液，置于4 ℃备用。

1.2.2 真菌粗多糖制备 试验使用6 种真菌子实体，包括平菇（Pleurotus ostreatus）、姬松茸（Agaricus blazei）、云芝（Coriolus versicolor）、杏鲍菇（Pleurotus eryngii）、灵芝（Ganodermalucidum）、桑黄（Phellinus igniarius），粗多糖提取步骤如下[13-15]：（1）在干燥箱37 ℃条件下干燥24 h，将子实体彻底烘干；（2）上述烘干后的子实体各取150 g，利用中药小型粉碎机打成细粉，按照水料质量比15∶1，各子实体粉末中加入去离子水，95 ℃水浴6 h 后过滤，滤渣重复水提一次，收集最终滤液，经4000 r/min 高速离心15 min 去除沉淀、循环真空水泵抽滤3 次，获得无明显颗粒杂质的滤液，60 ℃ 下旋转蒸发仪20 r/min 将滤液真空浓缩至原体积的1/5；（3）按体积比1∶1，将配好的sevage 工作试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1）加入浓缩滤液中，震荡30 min后，经4000 r/min 高速离心15 min，保留上层多糖溶液，去除下层含蛋白质的溶液，重复离心至下层溶液完全去除干净；（4）加入4 倍体积的95%乙醇，与浓缩液充分混合，置于4 ℃冰箱静置21 h，经4000 r/min 高速离心15 min，收集沉淀，加入少量去离子水复溶沉淀，再次醇沉，收集所有沉淀置于37 ℃烘箱放置1 h，除去残留的乙醇溶液，然后经过冷冻干燥仪冻干，得到子实体粗多糖。

1.2.3 多糖理化性质测定 多糖化学组成测定包括总糖、蛋白质、糖醛酸、硫酸基含量。采用苯酚硫酸法测定总糖含量[16]；采用考马斯亮蓝测定蛋白质含量[17]；采用硫化钡-明胶法测定硫酸基含量[18]；采用间羟基联苯法测定多糖糖醛酸含量[19]。

1.2.4 抗TMV 粗多糖筛选 药效测定参照陈年春[20]、逄丽丽等[21]的半叶法。

（1）粗多糖对TMV 的钝化作用。选取7 叶期长势一致的心叶烟，TMV 病毒粒子为接种物（按1∶100 稀释），利用去离子水将粗多糖分别稀释至6、12、24 mg/mL，病毒分别与多糖溶液1∶1 混合，静置30 min，采用半叶法摩擦接种到心叶烟的左半叶，右半叶接种去离子水与病毒混合液作对照。每个处理3 株，重复3 次。将处理后的叶片置于25～28 ℃、湿度70%～80%的条件下5～6 d。记录形成的枯斑数，根据公式计算钝化率，评定真菌多糖对TMV 的钝化效果。

式中，C 表示空白对照组的枯斑数量；T 表示处理组的枯斑数量。

（2）粗多糖对TMV 的预防作用。将稀释为6、12、24 mg/mL 的粗多糖溶液分别喷施到心叶烟叶片半叶，另半片叶喷去离子水作对照，连续处理3 d。在最后一次喷施24、48 h 后，分别对各处理的叶片全叶接种病毒。然后置于温室中培养5～6 d。记录形成的枯斑数，根据公式计算预防率，评定真菌多糖对TMV 的防御效果。

式中，C 表示空白对照组的枯斑数量；T 表示处理组的枯斑数量。

（3）粗多糖对TMV 的治疗作用。将供试病毒摩擦接种到7 叶期的心叶烟叶片，分别在24、48 h 后，将粗多糖溶液分别喷施到心叶烟叶片半叶，另半片叶喷去离子水作对照，连续处理3 d。培养5～6 d 记录形成的枯斑数，根据公式计算抑制率，评定粗多糖对TMV 的治疗效果。抑制率计算公式如下：

式中，C 表示空白对照组的枯斑数量；T 表示处理组的枯斑数量。

1.2.5 五点注射法 由本实验室保存的TMVGFP农杆菌菌株，在含有50 μg/mL Kana 和25 μg/mL Rif LB 液体培养基中，28 ℃ 180 r/min条件下培养24 h。5000 r/min 室温离心10 min，吸取上清液保留沉淀，加入5 mL 侵染液将菌体沉淀重悬，直至菌液OD600 为0.8 左右。28 ℃90 r/min 诱导4 h。侵染液配置见表1。

选取培养1个月左右，生长状况良好、长势一致的本氏烟草，用一次性注射器吸取药剂，避开叶片主脉、次脉选取5 个点，使药剂连成环注射烟草叶片背面。用去离子水作对照，3次重复。24 h 后，在药环的中心注射制备的TMV-GFP 农杆菌菌液，黑暗培养12 h，光照培养2、5 d 后紫外灯照射，每天观察荧光斑点扩散情况。采用十字交叉法测定荧光斑直径，计算抑制率。

1.2.6 抗病粗多糖对系统寄主防效测定 将对TMV 防治效果较好的粗多糖稀释为6、12、24、48 mg/mL， 分别喷施5～7 叶期且长势一致的NC-89 烟草上，48 h 后接种病毒，各处理40 株，重复3 次。以清水为阴性对照，1.8%辛菌胺醋酸盐水剂（60 mg/L）为阳性对照1，0.5%香菇多糖水剂（26.25 mg/mL）为阳性对照2。处理后烟草置于防虫温室培养，待阴性对照烟苗明显发病后记录各处理组的发病情况。

按照病叶级数，计算各处理的病情指数。烟草病情分级标准及公式[22]如下：0 级为全株无病；1 级为新叶明脉，少数叶片轻花叶；3 级为全株1/2 叶片花叶，少数叶片变形或叶脉变黑；5 级为全株2/3 叶片花叶或有小枯斑，植株矮化，株高为健株1/2，结果少；7 级为全株叶片花叶或叶片枯斑连片枯死，植株严重矮化，不结果或结果畸形。

1.2.7 抗病粗多糖对TMV的大田防效测定 选取长势一致的烟草共42 行，每行40 株，自然发病，第1～6 行喷施0.5%香菇多糖水剂（26.25 mg/mL），7～12 行喷施1.8%辛菌胺醋酸盐水剂（60 mg/L），13～18 行喷施清水，19～24、25～30、31～36、37～42行分别喷施6、12、24、48 mg/mL 姬松茸粗多糖水溶液，每7 d 喷1 次，共喷3 次，试验期间不使用其他药剂，病叶级数标准及公式参照1.2.6。

1.3 数据处理

以各试验组防治效果数据为基础数据，采用Microsoft 365 Excel 软件进行数据整理并计算平均值、标准差和绘制图表；采用IBM SPSS Statistics19.0 软件进行显著性检验和Pearsons 相关系数分析。

2 结果与分析

2.1 6 种食用菌的粗多糖组分含量

经测定，6 种食用菌多糖中，姬松茸粗多糖提取率最高，达24.32%，其次为平菇18.56%， 最低为杏鲍菇（表2）。总糖含量中，姬松茸总糖显著高于其他食用菌种类，达到37.71%，其次是桑黄和灵芝粗多糖总糖含量，均超过32.00%。云芝粗多糖的糖醛酸含量為6.81%，显著高于其他5种食用菌粗多糖，其次是灵芝粗多糖。姬松茸粗多糖硫酸基含量高达2.10%，已有研究表明，硫酸基含量影响多糖的许多生物活性功能[23]。

2.2 抗TMV 病毒的粗多糖筛选

通过半叶法测定粗多糖的药效，结果如表3所示，6 种食用菌粗多糖对TMV 均具有一定的防治效果。均以喷施多糖溶液48 h 后接种病毒的预防效果最好，姬松茸、云芝、平菇粗多糖的预防率可达到60.00%以上， 尤其姬松茸粗多糖24 mg/mL 处理的预防效果最好，高达92.04%；其次是12 mg/mL 姬松茸粗多糖的预防率为86.91%。6 种食用菌粗多糖对TMV 的治疗效果不明显，除了接种病毒24 h 后喷施24 mg/mL 姬松茸粗多糖的治疗效果可达到44.53%以外，其余处理的预防效果均低于42.00%。食用菌多糖对TMV 的钝化效果比预防效果差，除24 mg/mL 平菇粗多糖处理组钝化率为62.41%，其他均低于60.00%。不同时间姬松茸粗多糖处理叶片对TMV 的预防效果存在差异，处理48 h 后叶片的预防效果优于处理24 h 后。粗多糖的使用浓度和处理方式对防治效果均有一定影响，部分粗多糖在相同浓度不同施药方式下对病毒的抑制效果不同，此外，相同施药方式的抑制效果也并未随施药浓度的增加而提高。

2.3 绿色荧光蛋白标记试验

将24 mg/mL 姬松茸粗多糖按照五点注射法流程处理烟草，黑暗培养12 h 后注射点绿色荧光蛋白的表达随着时间的推进，荧光点的大小、强弱均发生变化（图1A，图1D），这间接反映了病毒的分布、扩散和增殖情况。在光照培养2 d后， 粗多糖处理组的荧光斑直径（ 平均直径0.83 cm）明显小于去离子水对照组（平均直径1.18 cm），抑制率为29.66%（图1B，图1E）。并且光照培养5 d 时，粗多糖处理后的荧光斑点亮度弱于对照组（图1C，图1F），说明其在病毒侵染前期对TMV 的增殖有抑制作用，明显可看出对照组荧光区域进一步扩大（ 平均直径1.65 cm），荧光点开始明显向叶片其他区域移动，新叶上发现少量荧光点，光照培养5 d，粗多糖处理组（平均直径1.02 cm）与光照培养2 d 时相比，荧光区域变化不大且新叶未出现荧光点，抑制率为38.18%。表明姬松茸粗多糖延缓了TMV 的移动速度，减缓系统侵染进程。

2.4 姬松茸粗多糖对系统寄主的防效

姬松茸粗多糖在系统寄主NC-89 上对TMV有一定的防治效果（表4）。与对照相比，处理组烟苗的病情指数明显降低，6、12、24 mg/mL姬松茸粗多糖对病毒的相对防效均在52.00%以上，在48 mg/mL 濃度时植株出现损伤，多糖浓度过高在植株表面形成沉淀，引起植株黄化。当粗多糖浓度为24 mg/mL 时，对TMV 的防治效果高达76.81%，其防治效果略高于0.5%香菇多糖水剂和1.8%辛菌胺醋酸盐水剂处理组。姬松茸多糖能有效防治TMV，延迟植株发病，有利于烟草的生长。

2.5 姬松茸粗多糖对TMV 的大田防效试验

在发病烟草田中第3 次喷洒24 mg/mL 姬松茸粗多糖溶液后7 d，对TMV的防治效果为70.31%，略低于0.5%香菇多糖水剂和1.8%辛菌胺醋酸盐水剂处理组（表5）。48 mg/mL 姬松茸粗多糖溶液在第2 次施药后，植株出现黄化，局部叶片坏死的情况。姬松茸粗多糖对TMV 的防治效果十分显著，对叶片扭曲、卷缩、停止生长的植株有明显改善，病情指数低的植株完全能够恢复正常。同时对TMV 有一定的抑制作用，喷施过姬松茸粗多糖的烟草发病时间延后，烟草长势良好，叶片伸展，而喷施清水的植株明显矮化，叶片发黄。

3 讨论

已有研究得出糖醛酸含量较高的多糖具有某些特殊生理活性，一般高含量糖醛酸多糖大多出现在植物类多糖中[24]。本研究得出，云芝粗多糖的糖醛酸含量为6.81%，显著高于其他5 种食用菌多糖，高于刘玮[25]研究的糖醛酸含量，其原因可能是原材料的品种、产地及栽培方式不同导致的。硫酸基含量指多糖结构中所带的硫酸基的个数，本研究测得姬松茸粗多糖硫酸基含量高达2.10%，施娅楠等[23]研究得出，多糖的许多生物活性功能与硫酸基含量有直接关系，导致多糖的抗氧化性存在差异，进而可能影响其抗病毒或抑菌能力。如BACH 等[26]通过1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、2，2′-联氮双-二胺盐（ABTS）法测定不同真菌提取物的抗氧化能力，观察到DHHP 法中的抗自由基活性依次为：巴西蘑菇>双孢蘑菇>香菇>金针菇，ABTS 法中依次为：巴西磨菇>双孢蘑菇>金针菇>香菇。

烟草花叶病毒（TMV）依赖寄主提供的场所、底物和酶等一系列物质在寄主活细胞内进行自我复制和装配[26-28]。真菌多糖不仅能针对病毒粒子，也能作用于寄主植株，诱发寄主抗病性[29]。真菌多糖对烟草花叶病有一定的抑制作用，喷施多糖溶液48 h 后接种TMV 的预防效果较好，姬松茸、云芝、平菇粗多糖的预防效果均达到60.00%以上。尤其是24 mg/mL 姬松茸粗多糖处理的预防效果最好，高达92.04%。从总体来看，真菌多糖对TMV 的预防效果较好，与沈小英等[30]的研究结果一致，其他报道的扫把菌、奶浆菌、安络小皮伞和火碳菌等多糖对TMV 的防治效果超过80%[31]。从产品的生产成本来看，人工种植菌株更有优势。

室内试验表明，姬松茸粗多糖的防治效果稍优于香菇多糖，而大田试验防效略低，与标准农药产品相比，由于技术上的差异，姬松茸多糖水溶液的稳定性和纯度不够。施药方式不同，姬松茸多糖均能相应缓解植株的病情，但防治效果有差异，这可能与姬松茸多糖的作用方式有多指向性，既能切断病毒与细胞的结合，还能抑制病毒复制，或保护寄主植株有关。