缺血性脑卒中患者外周血microRNA差异性表达与患者临床预后的关系

王 逍,李 庆,黄晓峰,王秋月,张卓然

(1.陕西中医药大学附属医院脑病医院一病区,陕西 咸阳 712000; 2.西安医学院附属宝鸡医院神经内科,陕西 宝鸡 721006; 3.陕西省中医医院老年病科,西安 710000)

脑卒中是中老年人高发的急性脑血管疾病,对患者的生命健康构成极大威胁。脑卒中的起因是脑血管破裂或阻塞,导致脑部血流无法正常循环,进而造成脑组织发生氧化应激和炎症损伤。脑卒中造成的损害通常是不可逆的,极有可能导致患者身体功能障碍,甚至死亡[1]。脑缺血性卒中(CIS) 是最常见且最危险的卒中类型[2],约占所有卒中病例的60%～70%,主要由颈内动脉和椎动脉的闭塞或狭窄引起。目前,CIS的临床诊断仍较为复杂,只能通过相关血液标志物结合头部影像来判断,治疗方案以手术为主。有相当数量的CIS患者因无法得到及时、快速和有效的治疗,因而遭受不可逆的神经损伤甚至生命危险[3]。因此,寻找新的CIS诊疗方案是临床研究的热门课题。

MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性非编码小RNA(约22 nt),其可通过与mRNA的3′端UTR结合来抑制靶基因的生物学功能。miRNAs的异常表达与包括脑血管病在内的多种疾病的发生、发展密切相关[4]。循环miRNA也是癌症、卒中和2型糖尿病等疾病的外周生物标志物。血清循环miRNA-221-3p和miRNA-382-5p可用作非侵入性诊断CIS的潜在生物标志物,miR-34b可以防止局灶性脑缺血再灌注损伤(IRI)[5]。 miRNAs在血清中稳定表达,循环miRNAs的检测方法灵敏准确,这意味着miRNAs具有作为诊断各种疾病的生物标志物的潜力。有研究[6]揭示了miRNAs在CIS患者脑组织和外周血中的异常表达,提示miRNAs与CIS的发病机制、诊断和预后有关。本研究评估CIS患者外周血miRNAs差异性表达与患者临床预后的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2019年6月至 2021年6月于陕西中医药大学附属医院就诊的CIS患者36例,健康体检者25例。纳入标准:1)检查确诊为CIS;2)病例资料完整;3)患者或家属对本研究知情同意。排除标准:1)合并肿瘤、其他心脑血管疾病、自身免疫缺陷病、感染性疾病或精神疾病者;2)器官功能障碍或药物过敏者;3)入院前3个月内接受过抗生素或手术治疗者;4)怀孕或哺乳期患者;5)转诊患者;6)预期寿命<1个月者。本院伦理委员会审核批准了本研究。

收集记录患者年龄、性别、美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分、梗死体积、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TCH)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)[Lp(a)]。分别在卒中发病后24 h和7 d进行2次NIHSS评估,以评价短期预后。CIS发病后,于1个月、3个月、6个月和12个月进行回访,以评价长期预后。

1.2 CIS患者外周血差异性表达miRNA筛选

健康体检者和CIS患者的血液样本在采集后4 h内进行预处理,将血清在4 ℃下以 12 000 rpm离心10 min,储存于-80 ℃备用。使用miRNeasy Micro Kit(美国QIAGEN公司)提取CIS患者外周血miRNA。选择3例健康体检者和3例CIS患者使用高通量测序(HTS)分析和筛选差异性表达的miRNA,在CIS患者发病第2天(急性期)和第10天(恢复期)分别提取2次样本。HTS委托北京诺和致远生物科技有限公司完成,测序方式为HiSeq/MiSeq。

1.3 定量实时聚合酶链式反应(qPCR)

使用miRNA提取分离试剂盒(天根生化科技公司)提取血清样本中的总RNA进行逆转录,然后使用RealMasterMix Probe试剂盒(天根生化科技公司)进行qPCR检测。反应系统和循环条件:8 μL 2.5×RealMasterMix,正向引物和反向引物各1 μL(5 pmol·L-1,由Thermo Fisher Scientific公司设计)、1 μL 20×Probe Enhancer溶液、1 μL模板溶液和7 μL双蒸水。反应条件:94 ℃ 2 min,94 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min,重复43个循环。miRNA的表达水平以2-△△Ct分析,内参为U6。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 CIS患者外周血miRNA的差异性表达

HTS结果显示,急性期和恢复期的CIS患者相比较,其外周血样本中共有59个差异性表达的miRNA,其中上调30个,下调29个,包括miR-328-3p、miR-1301-3p、miR-320a等血清外泌体miRNA(图1A)。急性期CIS患者与健康对照组相比,共有27个差异表达的miRNA,其中15个上调和12个下调的miRNA(图1B)。

A:基于缺血性脑卒中患者急性期和恢复期之间不同表达 miRNA 的倍数变化和后验概率火山图;B:3组miRNA的表达差异热图(SE:急性期CIS患者,n=3;SL:恢复期CIS患者,n=3;N:健康对照者,n=3)。

2.2 CIS患者与健康体检者的临床特征比较

将CIS患者和健康体检者的临床资料进行比较,结果显示2组GLU、TCH水平差异无统计学意义(P>0.05),2组HDL-C、LDL-C、miR-328-3p和Lp(a)水平均有明显差异(P<0.05),见表1。

表1 CIS患者与健康体检者的临床特征比较

2.3 CIS患者外周血miR-328-3p的表达水平与临床特征的相关性

与健康体检者比较,CIS患者外周血miR-328-3p表达水平较低(P<0.05)。此外,脑梗死体积≥10 cm3的CIS患者外周血miR-328-3p表达水平明显低于梗死体积<10 cm3的患者(P<0.05);且急性期患者外周血miR-328-3p水平明显低于恢复期患者(P<0.05);短期预后不良的患者与短期预后良好的患者相比,miR-328-3p水平较低(P<0.05)。此外,急性期CIS患者外周血miR-328-3p水平与NIHSS评分相关(r=-0.694,P<0.05),恢复期CIS患者外周血miR-328-3p水平亦与NIHSS评分相关(r=-0.559,P<0.05)。见图2。

A:不同梗死体积的CIS患者的miR-328-3p表达水平;B:CIS急性期、恢复期和健康对照组的miR-328-3p表达水平;C:miR-328-3p在短期预后良好和短期预后不佳患者中的表达情况(良好,n=28;不佳,n=8);D—E:miR-328-3p的表达水平与NIHSS评分的相关性。

2.4 外周血miR-328-3p的表达水平对CIS患者预后的预测价值

绘制外周血miR-328-3p预测CIS患者预后的ROC曲线,结果显示急性期miR-328-3pAUC为0.920(95%CI:0.820～1.000),恢复期miR-328-3p的AUC为0.833(95%CI:0.701～0.965),均P<0.05。见图3。

图3 外周血中miR-328-3p表达水平对CIS

3 讨论

CIS是一种全球高发的危重疾病,是世界范围内导致成人残疾的主要原因之一,由于其致病因素和诊疗方案的复杂性,CIS的潜在危险十分显著[7]。深入挖掘CIS发病的分子机制是临床研究的热点。本研究利用HTS技术探索了CIS患者外周血miRNA的差异性表达及其与患者临床预后的关系。

miRNA存在于人体血液、体液和组织中,能够通过相对方便快捷的方法进行检测[8]。传统CIS的诊断过程复杂,不仅耗费大量的时间,而且经济成本高昂,无法实现大规模的临床筛查,这使得CIS的早期诊断率较低。而早期诊断和及时治疗对降低CIS患者高死亡率和改善其预后具有关键性意义[9]。有研究[10]表明,miRNA是CIS相关细胞生物学过程的关键调控者。本研究检测了CIS患者和健康体检者外周血中miRNA的表达情况,CIS患者急性期和恢复期比较得到59个差异性表达的miRNA,其中上调30个,下调29个,其中包括血清外泌体miRNA:miR-328-3p、miR-1301-3p和miR-320a。

CIS是由一系列病理生理事件组成的,包括炎症、氧化应激和细胞凋亡[11]。外周血miR-124可作为CIS的分子标志物,它可通过JNK信号通路加速CIS大鼠内皮祖细胞的增殖[12]。有证据[13]表明miR-24可抑制CIS大鼠的脑组织细胞凋亡。电针治疗可以通过调节血管内皮生长因子家族基因表达来平衡miR-328的水平,以促进缺血性大脑皮层组织的血管生成[14]。本研究发现CIS患者外周血miR-328-3p水平显著低于健康患者,且与卒中梗死体积呈负相关。此外,外周血miR-328-3p水平还与CIS患者短期预后相关,与短期预后良好的患者相比,短期预后较差的患者外周血miR-328-3p的水平较低。因此,外周血miR-328-3p水平可能是CIS的预后因素。

NIHSS是评价脑血管病神经损伤程度的重要观察指标之一:NIHSS评分越高,患者的神经损伤越严重[15]。经过Pearson相关系数分析,本研究发现CIS患者外周血miR-328-3p水平与其NIHSS评分呈负相关。此外,通过ROC曲线分析发现急性期CIS患者外周血miR-328-3p水平AUC为0.92,miR-328-3p相对表达量<0.515时,预测CIS的敏感度和特异度分别为78.6%和53.6%,且敏感度随着患者病情的严重程度逐渐升高。因此可初步确定外周血miR-328-3p具有预测CIS的潜力。

综上所述,CIS患者和健康受试者外周血内多种miRNA存在表达差异,其中miR-328-3p在CIS的预后预测中具有一定价值,具有成为新的CIS生物标志物的潜力。但本研究为单中心、小样本研究,所获结论尚需后续多中心、大样本研究证实。