ZMPSTE24表达水平与原发性胶质瘤的关系:一项基于CGGA数据库的研究

王长峰,陈显俊,朱 滢,欧 跃,刘如恩,2

(1.江西省人民医院、南昌医学院第一附属医院神经外科,南昌 330006; 2.北京大学人民医院神经外科,北京 100044; 3.南昌大学基础医学院,南昌 330006)

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,全球年发病率约6/10万,男女比例约为1.6：1[1]。在病理学上,胶质瘤可分为星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤或混合胶质瘤,其中星形细胞瘤最常见[2]。依据世界卫生组织的划分,神经胶质瘤根据其恶性程度分为四级(Ⅰ—Ⅳ)。其中,Ⅰ级和Ⅱ级胶质瘤是低级别肿瘤,如果能完全切除,预后良好;而Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤属于高级别肿瘤,恶性度高,切除困难,易复发[3]。胶质瘤发展到晚期(Ⅳ)时可能演变为胶质母细胞瘤(GBM)。目前手术切除、化疗和放射治疗是神经胶质瘤的标准治疗方法,但术后胶质瘤复发率高,预后较差。在传统治疗模式遭遇瓶颈的现状下,基于组织学结合分子标记物的胶质瘤诊断、预后评估和治疗已成为疾病管理的重要里程碑。相关研究[4]已经表明,胶质瘤的形成与细胞信号通路异常密切相关,因此寻找相关分子标记物在胶质瘤的诊治过程中具有重要意义。

ZMPSTE24是一种膜锌金属蛋白酶,最初在酵母中发现,是层黏连蛋白A成熟过程中所需的酶[5]。有研究[6]表明,ZMPSTE24缺陷小鼠的细胞表现出延迟的DNA损伤反应、非整倍体增加和基因组不稳定性升高,是癌细胞的行为特征。ZMPSTE24通过突变途径和表达途径共同参与具有MSI-H表型的胃癌和结直肠癌的发生发展[7]。ZMPSTE24是参与人类早衰症病理机制的关键蛋白酶,同时参与抗病毒免疫途径的组成,进而调节免疫水平[8]。目前,ZMPSTE24表达水平对脑胶质瘤患者的意义鲜有研究。本研究应用生物信息学方法分析中国胶质瘤基因组图谱计划(Chinese glioma genome atlas,CGGA)数据库中的数据[9],探究ZMPSTE24在脑胶质瘤中的表达及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 数据来源

从CGGA中下载325例胶质瘤患者的临床数据和mRNA测序数据[9-10]。提取ZMPSTE24基因表达量与临床数据配对合并,同时剔除部分临床数据缺失的病例(32例)。使用R软件(4.2.1)提取ZMPSTE24基因的表达量,使用Mann-WhitneyU检验分析2组之间基因表达水平的差异。根据胶质瘤患者的发病状态,分为原发性胶质瘤(210例)和复发性胶质瘤(83例)。依据ZMPSTE24基因在原发性胶质瘤患者组织中表达量的中位值(18.61)将入选病例分为高表达组(105例)和低表达组(105例),用于进一步分析ZMPSTE24基因表达量在不同类型原发性胶质瘤患者中的临床意义。ZMPSTE24高表达和低表达组原发性胶质瘤患者的基线资料比较见表1。

1.2 统计学方法

所有统计分析均使用R软件(4.2.1)进行。临床因素与ZMPSTE24表达之间的相关性采用Wilcoxon符号秩检验和Logistic回归进行评估。使用Cox回归和Kaplan-Meier方法确定与低级别胶质瘤患者总生存率相关的临床因素。进一步进行时间依赖性受试者操作特征(ROC)曲线分析,以确定ZMPSTE24的预测准确性。多变量Cox分析用于探讨ZMPSTE24表达在生存预测中的作用以及其他临床特征(年龄、分级、性别)。采用Shapiro-Wilk检验连续变量的正态性。正态分布数据的结果以平均值(标准差)表示,非参数数据的结果则以中值(四分位间距或IQR)表示。分类变量以计数(百分比)表示,并使用Pearsonχ2检验或Fisher精确概率法进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

1.3 功能富集分析

为了研究ZMPSTE24表达影响原发性胶质瘤进展的潜在机制,使用R软件(V.4.2.1)进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)筛选ZMPSTE24高表达和ZMPSTE24低表达组之间存在显著差异的生物通路[11]。对于每一个分析,基因组排列被执行1000次。假发现率(FDR)<0.05和调整后P<0.05的基因组被认为显著富集,同时鉴定出显著富集的基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路。

1.4 共表达分析

用limma软件包收集与ZMPSTE24表达相关的基因。共表达的阈值为相关指数>0.5和P<0.001。此外,利用Corrplot和Circlize软件包描述与ZMPSTE24共表达的基因。

1.5 蛋白质相互作用网络的构建与枢纽基因的选择

ZMPSTE24被导入STRING数据库(版本:11.5b,https://string-db.org),以识别物理和功能相互作用的基因和蛋白质[12]。以综合评分>0.45构建蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,并通过Cytoscape进行进一步可视化。利用Cytoscape version 3.9.1(http://www.cytoscape.org/)的CytoHubba插件,通过最大集团中心度(maximal clique centrality,MCC)算法筛选出PPI网络中交互作用程度最高的前5个中心性基因。

1.6 免疫细胞浸润分析

采用TIMER2.0数据库分析ZMPSTE24表达与B细胞、CD+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、髓系树突状细胞(myeloid dendritic cells,DCs)的关系[13]。P<0.001为ZMPSTE24与免疫细胞浸润显著相关的阈值。

1.7 免疫组织化学分析

应用来自人类蛋白图谱数据库(The human protein atlas,HPA,http://www.proteinatlas.org)的免疫组织化学数据比较正常脑组织和胶质瘤组织中ZMPSTE24的蛋白表达水平。

1.8 蛋白印迹实验

临床收集的胶质瘤标本病理诊断分别为H1(Ⅱ级胶质瘤)、H2(Ⅱ级胶质瘤)、H3(Ⅲ级胶质瘤)、H4(Ⅲ级胶质瘤)、H5(Ⅳ级胶质瘤)。将液氮中的病理组织用研钵研磨后,使用蛋白提取液在4 ℃、12 000 g的条件下离心15 min。提取上清保存于-80 ℃进行分析。蛋白浓度测定采用BCA法(Beyotime)。等量的蛋白质装载在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,然后通过电泳转移到聚偏氟乙烯膜上。用5%牛血清白蛋白在室温下孵育2 h,ZMPSTE24一抗(FineTest)在4 ℃下孵育过夜。将Tris缓冲盐水与吐温-20洗涤液混合3次(5 min·次-1),加入1：20万稀释双荧光抗体,室温孵育1 h。使用SPECTRA MAX SoftMax Pro分析软件检测薄膜上各波段的光密度(OD)信号强度。用β-肌动蛋白作为负荷控制和标准化。

2 结果

2.1 ZMPSTE24的表达与原发性胶质瘤临床特征的关系

分析CGGA数据库中210例原发性胶质瘤患者的mRNA表达谱,结果表明ZMPSTE24的表达量与原发性胶质瘤患者的WHO分级、年龄分组、是否化疗、IDH分型高度相关(均P<0.001),与性别、是否放疗无相关性(均P>0.05)。见图1。

A:ZMPSTE24在不同肿瘤分级患者中的表达;B:ZMPSTE24在不同年龄患者中的表达;C:ZMPSTE24在不同性别患者中的表达;D:ZMPSTE24在是否化疗患者中的表达;E:ZMPSTE24在是否放疗患者中的表达;F:ZMPSTE24在不同IDH分型患者中的表达。

2.2 ZMPSTE24的表达与原发性胶质瘤患者总生存率的关系

在原发性胶质瘤患者中,ZMPSTE24的表达量与总生存率相关,ZMPSTE24低表达组的总生存时间较ZMPSTE24高表达组明显延长(图2A)。在Ⅱ、Ⅲ级原发性胶质瘤患者和Ⅳ级原发性胶质瘤患者中,ZMPSTE24表达水平与总生存率同样相关(图2B—C)。预测原发性胶质瘤患者1、3和5年预后的ZMPSTE24曲线下面积(AUC)值分别为0.768、0.850和0.858(图2D)。分析Ⅱ、Ⅲ级原发性胶质瘤患者和Ⅳ级原发性胶质瘤患者1、3和5年预后的ZMPSTE24曲线下面积(AUC)值分别为0.853、0.810、0.810和0.545、0.776、0.748(图2E—F)。提示ZMPSTE24预测Ⅱ、Ⅲ级原发性胶质瘤患者生存期的能力更强。

A:ZMPSTE24表达与原发性胶质瘤患者总生存率的相关性;B:ZMPSTE24表达与Ⅱ、Ⅲ级患者总生存率的相关性;C:ZMPSTE24表达与Ⅳ级患者总生存率的相关性;D:原发性胶质瘤患者的时间依赖性ROC曲线;E:Ⅱ、Ⅲ级患者的时间依赖性ROC曲线;F:Ⅳ级患者的时间相关ROC曲线。

2.3 原发性胶质瘤的单因素和多因素COX回归分析

单因素Cox回归分析显示:年龄、肿瘤分级、是否化疗、IDH分型和ZMPSTE24表达量与总生存期存在相关关系(均P<0.05)。性别和是否放疗与总生存期无相关关系(均P>0.05)。多因素Cox回归分析显示:肿瘤分级、IDH分型和ZMPSTE24表达量与总生存期存在相关关系(均P<0.05);年龄、性别、是否化疗、是否放疗与患者总生存期无相关关系(均P>0.05)。见表2。

表2 原发性胶质瘤的单因素和多因素COX回归分析结果

2.4 GSEA富集分析

与MTMR14高表达密切相关的6个KEGG途径为:基底转录因子、RNA降解、卵母细胞减数分裂、泛素介导的蛋白水解作用、N-多糖生物合成、细胞周期(图3)。各富集通路富集分数及校正q值见表3。

基底转录因子、RNA降解、卵母细胞减数分裂、泛素介导的蛋白水解作用、N-多糖生物合成、细胞周期与MTMR14表达正性相关。

表3 基于ZMPSTE24表达的KEGG富集分析

2.5 ZMPSTE24的共表达分析

图4显示与ZMPSTE24负相关的前3个基因以及正相关的前6个基因。结果表明,ZMPSTE24的表达水平与SLC35F5、FPGT、SLC39A1、SF3A3、SEC22B、SERBP1呈正相关关系(Cor>0.5,P<0.001),与MT-ND4、MT-RD4、GABBR1呈负相关(Cor<-0.5,P<0.001)。

2.6 蛋白质相互作用和免疫细胞浸润分析

ZMPSTE24的蛋白网络图见图5A。通过CytoHubba插件确定的前5个中心性基因,并按照MCC评分进行排序,确定连接最紧密的蛋白(图5B)。TIMER2.0显示ZMPSTE24的表达与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、髓系树突状细胞(DCs)有显著差异(partiral.cor>0.45,P<0.001)(图5C)。

A:ZMPSTE24的蛋白网络图,连线表示蛋白之间存在相互作用,线段粗细表示蛋白相互作用的程度;B:排名前5位的中心性基因分别为ZMPSTE24、ICMT、RCE1、FNTA和LMNB2(红色的强度表示等级)。

C:ZMPSTE24与B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞的评分及相关趋势。

2.7 免疫组织化学分析

从HPA中检索免疫组织化学染色数据。在正常脑组织中,脑细胞通常具有较弱ZMPSTE24染色(图6A);原发性胶质瘤组织具有较强的ZMPSTE24染色(图6B)。利用5例临床采集的肿瘤组织,进行蛋白印迹实验,结果表明肿瘤级别越高,ZMPSTE24表达水平相对越高(图6C)。

A—B:从HPA中检索免疫组织化学染色数据,A为正常脑组织(患者ID:2512);B为原发性胶质瘤组织(患者ID:3120);C:蛋白印迹实验(n=5)。

3 讨论

在中枢神经系统肿瘤中,胶质瘤是最常见的类型。在世界卫生组织依据其恶性程度的分级中,级别越高,意味着更大的治疗难度、更容易复发以及更高的病死率[14]。因此,准确地评估预后对于在疾病早期选择最合适的治疗以改善患者预后至关重要。有研究[15]表明,基于生物标志物的癌症治疗可以有效改善某些恶性肿瘤的预后。因此,本研究主要分析ZMPSTE24与原发性胶质瘤的关联和潜在机制。本研究结果显示,ZMPSTE24表达水平与原发性胶质瘤的发生发展、恶性程度及预后密切相关。尤其ZMPSTE24表达水平越高,意味着原发性胶质瘤的恶性程度越高。同时,ZMPSTE24高表达的原发性胶质瘤患者总生存期比ZMPSTE24低表达组显著降低。

ZMPSTE24是一种膜锌金属蛋白酶,参与人类早衰症病理机制[16]。最新研究[7]表明,ZMPSTE24通过突变途径和表达途径共同参与了具有MSI-H表型的胃癌和结直肠癌的发生发展。通过PPI网络构建与枢纽基因筛选,获得ZMPSTE24相互作用的蛋白分子,同时以MCC评分为准,筛选出ZMPSTE24蛋白网络中重要的节点蛋白,如异戊烯基内肽酶(RCE1)、异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶(ICMT)等。其中,RCE1在真核生物多种信号通路中扮演着非常重要的角色,参与了真核细胞的增殖、分化和癌变等过程[17]。现有研究表明RCE1与胶质瘤[18]、膀胱癌[19]、前列腺癌、舌鳞癌[20]等的发生发展密切相关。同时,有研究[21]表明ICMT参与了肝癌的转移过程和舌鳞癌的发生发展。此外,有研究[22-23]发现与ZMPSTE24共表达的SEC22B、SLC39A1、SERBP1等基因,与肝癌、胃癌、胶质瘤以及神经细胞修补密切相关。基于基因富集分析发现,ZMPSTE24可能参与泛素介导的蛋白水解作用、基底转录因子、细胞周期、RNA降解等重要分子通路。此外,依据TIMER2.0数据库研究数据,ZMPSTE24的表达与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、髓系树突状细胞(DCs)有显著差异,这意味着ZMPSTE24可能通过某种作用机制,影响胶质瘤的免疫浸润程度,进而对原发性胶质瘤的发生发展和预后产生相关影响。为进一步验证mRNA水平研究的可靠性,本研究通过HPA和临床病理组织免疫印迹实验发现,ZMPSTE24在胶质瘤组织的表达水平高于正常脑组织,且ZMPSTE24的表达水平与胶质瘤病理分级呈正相关。

本研究存在一些局限性。首先,仅在人类基因转录组水平上研究了胶质瘤中ZMPSTE24的特征,没有进一步研究其在体内或体外的功能;其次,ZMPSTE24在这些过程中的具体分子机制需要进一步探索。

总之,高水平的ZMPSTE24提示原发性胶质瘤的恶性程度较高,生存率较低,尤其在Ⅱ、Ⅲ级原发性胶质瘤中ZMPSTE24表达量可以用于预测患者的预后。因此,笔者推测ZMPSTE24可能是胶质瘤发病和发展的重要基因,或许可以作为原发性胶质瘤的独立预后因子和潜在治疗靶点。