一氧化氮对茶树不同组织响应铝胁迫的影响

邢安琪, 田志强, 储睿文, 徐晓寒, 尹 娟, 戴令聪, 林凡力, 杨亦扬, 王玉花

(1.南京农业大学园艺学院,江苏南京 210095; 2.江苏省农业科学院休闲农业研究所,江苏南京 210014;3.江苏茅山茶海有限公司,江苏常州 213200)

茶树[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]适合生长在pH值为4.5～6.5的酸性土壤。当土壤的pH值<5时,稳定的铝盐可转化为易被植物吸收的游离铝离子(Al3+)[1],从而影响植物的生长。铝毒是当前酸性土壤限制植物生长的一个主要因素。与其他植物相比,茶树具有“喜酸耐铝”的特性,其成熟叶片的铝含量可高达30 000 mg/kg而不表现铝毒害症状[2]。铝(Al)也是茶树根系生长的必需元素[3],在酸性条件下可促进茶苗新根生长,但过量的Al3+又影响茶树根系生长[4]。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的终产物,在植物遭受Al3+胁迫时,其含量在植物体内显著增加。研究发现,低浓度的铝有利于茶叶细胞膜的稳定性,但随着Al3+浓度的增加,茶树MDA含量也呈增加趋势,进而对茶树造成伤害[5]。Al3+胁迫不仅对细胞质膜有潜在伤害,并且对植物体内的酶活性也会产生影响。植物在遭受Al3+胁迫时,其体内的抗氧化系统能够发挥保护作用[6]。茶树也不例外,在Al3+胁迫下茶树体内的抗氧化系统发生变化,通过减少活性氧自由基等毒害物质而增加茶树的耐受性[7]。同时,Al3+胁迫也对茶叶的品质成分如茶多酚、儿茶素、氨基酸、咖啡碱等物质含量有一定的影响[8]。因此,探索茶树降铝措施对缓解茶树铝胁迫、减少茶叶中的铝含量以及提高茶叶品质具有非常重要的指导意义。

一氧化氮(NO)是一种广谱信号分子,植物主要通过酶促反应和非酶促反应生成内源NO。其中,酶促反应主要包括一氧化氮合酶(NOS)途径和硝酸还原酶途径[9]。NO广泛存在于植物的各种生理生化活动中,近年来的研究表明,NO同样是植物响应生物胁迫和非生物胁迫的重要信号分子。外源添加NO可以显著提高植物体内抗氧化酶活性,改善根系形态,促进玉米对胁迫的适应能力,有效缓解胁迫对玉米造成的损伤[10]。提前施用外源NO供体硝普钠(SNP)可显著缓解Al3+胁迫对根长的抑制并减少铝在根尖的积累,NO清除剂cPTIO[2-(4-carboxy-2-phenyl)- 4,4,5,5-tetramethylinidazoline-1-oxyl-3-oxide]则可以在 Al3+存在下完全逆转NO对根生长的影响[11]。此外,发现NO在小麦[12]和红芸豆[13]中均可以通过增强抗氧化酶活性进而减少ROS积累,明显缓解氧化胁迫。目前关于Al3+胁迫和NO信号分子关系的研究鲜有报道,并且缺少NO信号分子对茶树耐Al3+作用的研究。

本试验通过研究外源施加不同处理(对照、Al3+处理、Al3++NO释放剂DEA NONOate复合处理、Al3++NO清除剂cPTIO复合处理)对茶苗不同组织的影响,初步探索外源NO在茶树不同组织响应Al3+胁迫生理过程中发挥的作用,为进一步研究缓解茶树Al3+胁迫、降低茶树Al3+累积提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2021年6—7月在南京农业大学智能温室进行。供试材料为茶树品种龙井43的二年生扦插苗,由江苏省高淳市南京雅润茶业有限公司提供。将茶苗根部泥土清洗后转移到清水中预培养 3 d,之后参照小西茂毅营养液配方[14]在1/8、1/4、1/2浓度下各培养5 d,直至全营养液培养,营养液pH 值为5.5。最后在含有不同处理培养液的50 mL锥形瓶(锡纸包裹)中处理15 d,每瓶2株茶苗。每3 d更换1次处理液,并保持通气。培养光照度约230 μmol/(m2·s),昼/夜时长16 h/8 h,温度 25 ℃,空气湿度65%～80%。

1.2 测定方法

1.2.1 茶树不同组织Al3+含量的测定 对处理茶叶的各组织进行烘干、研磨后,称取0.1 g样品到消解管中,再添加2.5 mL浓硝酸,随后利用微波消解仪(MARS 6,美国CEM公司)进行样品消煮,最后使用ICP-OES电感耦合等离子体发射光谱仪(Optima 8000,美国珀金埃尔默仪器有限公司)测定不同处理下茶树各组织的Al3+含量。

1.2.2 茶树不同组织NO含量以及NOS活性的测定 茶树不同组织总NO含量参照一氧化氮(NO)测定试剂盒(A013-2-1,南京建成生物工程研究所)说明书进行测定。NOS活性的测定参照NOS检测试剂盒(A014-2-2,南京建成生物工程研究所)说明书进行检测。

1.2.3 茶树不同组织丙二醛、脯氨酸及抗氧化酶活性的测定 茶树不同组织内丙二醛含量的测定参照MDA检测试剂盒(A003-1-2,南京建成生物工程研究所,中国)说明书进行。茶树不同器官的脯氨酸(Pro)含量以及抗氧化酶活性测定参考李合生《植物生理生化试验原理和技术》的方法[16]。

茶树不同器官的脯氨酸(Pro)含量测定参考李合生的方法[16]。称取新鲜植物组织0.5 g,加入 5 mL 3%磺基水杨酸,沸水浴10 min后,冷却至室温。取上清液2 mL转移至另一试管,加入2 mL冰乙酸和3 mL酸性茚三酮,摇匀后沸水浴40 min,取出冷却后加入5 mL甲苯溶液,充分振荡后使其静置分层,吸取甲苯层在520 nm波长下比色。

茶树不同器官的抗氧化酶活性测定参考李合生的方法[16]。称取0.5 g新鲜植物组织,用提前预冷的62.5 mmol/L pH值7.8的磷酸盐缓冲液研磨匀浆;在4 ℃下,10 000 r/min离心30 min。取上清液保存于4 ℃以待测抗氧化酶活性。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定:将2.1 mL 62.5 mmol/L pH值7.8的磷酸缓冲液、0.1 mL 60 mmol/L 核黄素、0.3 mL 130 mmol/L甲硫氨酸(Met)、0.1 mL 0.3 mmol/L EDTA-Na2、0.2 mL 1.125 mmol/L四氮唑蓝(NBT)以及0.2 mL待测酶液混匀,置于4 000 lx光照下,反应30 min,于 560 nm 下比色。设置2个对照管,不照光为空白管。

过氧化物酶(POD)活性测定:将4 mL反应混合液[3 mL愈创木酚反应混合液、0.8 mL pH值7.0磷酸缓冲液与H2O2混合液(500 ∶1)、0.2 mL待测酶液]混匀。随后在470 nm波长下比色,从0开始计时,30 s读数1次,连续读取3 min。

公司的一次联谊会上，周启明刚好坐在钱海燕身边，两人一聊，还挺投机。而那天正好赶上宁波下大雨，他主动送她到公寓楼下。后来聊得多了，爱情也就来得顺理成章。

过氧化氢酶(CAT)活性测定:将1.5 mL pH值7.8的磷酸缓冲液、1.0 mL蒸馏水、0.2 mL待测酶液混匀,25 ℃条件下反应20 min。反应结束后,迅速加入0.3 mL 0.1 mol/L的 H2O2终止反应,在 240 nm 波长下进行测定,从0开始计时,30 s读数1次,连续读取3 min。

1.3 数据分析

使用Excel 2010、GraphPad Prism 8.0.1、IBM SPSS Statistics 20对试验数据进行统计处理。以Duncan’s新复极差法分析数据,使用不同字母表示数据间的显著差异性。

2 结果与分析

2.1 一氧化氮对茶树Al3+含量、NO含量以及NOS活性的影响

2.1.1 不同处理对茶苗各组织Al3+含量的影响 茶苗根系的Al3+含量在不同处理间具有显著性差异(P< 0.05)(图1-A)。其中,对照组根系的Al3+含量最低,为5.38 mg/L。Al3++NO处理组在茶树根系内的Al3+含量最高,为9.61 mg/L,相对于对照组显著升高了78.63%。其次是Al3+处理组的Al3+含量,为8.69 mg/L,与对照组相比显著提升了61.53%,而Al3++cPTIO处理组的Al3+含量显著低于Al3+处理组和Al3++NO处理组,但显著高于对照组。

茶苗茎部的Al3+含量在不同处理间具有一定差异(图1-B)。4组处理的茎部Al3+含量由高到底依次是Al3++NO处理组(1.81 mg/L)、Al3+处理组(1.39 mg/L)、Al3++cPTIO处理组(1.18 mg/L)、对照组(1.05 mg/L),其中Al3++NO处理组、Al3+处理组的Al3+含量均显著高于对照组,并且相较于对照组分别增加72.38%、32.38%。Al3++cPTIO处理组的Al3+含量虽然高于对照组,但无显著性差异(P>0.05)。

茶苗叶片内的Al3+含量在不同处理下的变化如图1-C所示,4个处理组之间均具有显著性差异。与根系Al3+含量变化类似,Al3++NO处理下的Al3+含量为3.88 mg/L,显著高于其他3组处理。并且与Al3+含量最低的对照组(2.06 mg/L)相比显著增加88.35%,与Al3+处理组(3.19 mg/L)相比显著增加21.63%,与Al3++cPTIO处理组(2.88 mg/L)相比显著增加34.72%。

2.1.2 不同处理对茶苗各组织NO含量以及NOS活性的影响 茶苗不同组织的NO含量在4组处理中产生不同的变化(图2-A、图2-B、图2-C)。其中,茶根系Al3++NO处理组的NO含量最高,为71.68 μmol/g,且显著高于Al3++cPTIO处理组(31.61 μmol/g)、Al3+处理组(57.40 μmol/g)和对照组(49.91 μmol/g)的NO含量。与NO含量最低的Al3++cPTIO处理组相比,Al3++NO处理组、Al3+处理组、对照组的NO含量分别增加了126.76%、81.59%、57.89%。此外,研究结果表明Al3+处理组和对照组之间无显著性差异(图2-A)。由图2-B可知,不同处理下茶苗茎部的NO含量以Al3++NO处理组的最高,为21.07 μmol/g,且比对照组(7.21 μmol/g)、Al3+处理组(9.98 μmol/g)、Al3++cPTIO处理组(5.82 μmol/g)显著升高192.23%、111.12%、262.03%。此外,发现对照、Al3+处理和Al3++cPTIO处理的茎部NO含量无显著性差异。由图2-C可知,不同处理组的茶苗叶片NO含量均存在显著性差异。在Al3++NO处理下,茶树叶片的NO含量为16.36 μmol/g最高,并显著高于对照组(6.38 μmol/g)、Al3+处理组(9.98 μmol/g)、Al3++cPTIO处理组(3.05 μmol/g)的NO含量。此外,与Al3++cPTIO处理组相比,其他3组的NO含量由高到低依次升高了436.39%、227.21%、109.18%。

茶苗根系的NOS相对活性在4组处理之间均具有显著性差异(图2-D、图2-E、图2-F)。由图2-D可知,茶苗根部对照组的NOS相对活性最低,而Al3++NO处理组、Al3+处理组、Al3++cPTIO处理组的NOS相对活性与对照组相比,分别升高了306.12%、183.68%、48.98%。由图2-E可知,茶苗茎部的NOS相对活性在不同处理下存在显著性差异。NOS相对活性在不同处理茎中由高到低依次为Al3++NO处理、Al3+处理、Al3++cPTIO处理、对照处理。与NOS相对活性最低的对照组相比,其余3组由高到低分别提高384.85%、193.94%、90.91%。由图 2-F 可知,茶苗叶片的NOS相对活性在4组处理中存在显著性差异。叶片NOS相对活性由高到低依次为Al3++NO处理组、Al3+处理组、Al3++cPTIO处理组、对照组。并且与NOS相对活性最低的对照组相比,其他3组分别提高了282.61%、193.48%、47.83%。

2.2 不同处理对茶苗各组织丙二醛及脯氨酸含量的影响

不同处理下茶苗不同组织的丙二醛(MDA)含量有一定的差异(图3-A、图3-B、图3-C)。由图3-A可知,对照组茶苗根部的MDA含量为 47.04 nmol/g,与其他处理组相比含量最低;Al3++cPTIO处理组茶苗根部MDA含量与对照组相比无显著性差异;Al3+处理组的MDA含量比对照组显著提高了27.18%,Al3++NO处理组的MDA含量最高,为68.52 nmol/g,相比对照组显著增加45.66%。由图3-B可知,茶苗茎部的MDA含量在对照组中最低,为9.71 nmol/g。Al3++NO处理组的MDA含量最高,显著高于对照组,比对照组增加约57.96%。Al3+处理组、Al3++cPTIO处理组茎部的MDA含量相对于对照组略有增加,但无显著性差异。由图3-C可知,不同处理下,茶苗叶片的MDA含量具有显著差异。其中对照组、Al3++cPTIO处理组的MDA含量相对较低,分别为4.09、7.16 nmol/g。Al3+处理组、Al3++NO处理组的MDA含量显著高于其他2组,其含量分别为11.25、14.83 nmol/g,并且与对照组相比,MDA含量分别升高了175.06%、262.59%。

不同处理下茶苗根部的脯氨酸含量差异显著(图3-D),与根部丙二醛含量变化趋势基本相同,均为Al3++NO处理组的脯氨酸含量最高,对照组的脯氨酸含量最低,分别为51.89、38.65 μg/g。Al3+处理组、Al3++cPTIO处理组的脯氨酸含量也比对照组显著增加。在不同处理下,茶苗茎部的脯氨酸含量也会发生显著性变化(图3-E)。其中,Al3+处理组、Al3++NO处理组的脯氨酸含量分别为11.22 、14.32 μg/g,显著高于对照组,而Al3++cPTIO处理组的脯氨酸含量略高于对照组,两者之间无显著性差异。由图3-F可知,茶苗叶片的脯氨酸含量在不同处理下具有显著性差异。脯氨酸含量由高到低依次是Al3++NO处理组(62.84 μg/g)、Al3+处理组(52.16 μg/g)、Al3++cPTIO处理组(46.76 μg/g)、对照组(40.27 μg/g)。与对照组相比,Al3+处理组的脯氨酸含量升高29.53%,Al3++NO处理组的脯氨酸含量升高了56.05%,Al3++cPTIO处理组的脯氨酸含量升高了16.12%。

2.3 不同处理对茶苗各组织抗氧化酶活性的影响

茶苗根系的超氧化物歧化酶活性在不同处理之间差异显著(图4-A、图4-B、图4-C)。由图 4-A 可知,Al3++NO处理时茶苗根系的SOD活性最高,其次为Al3+处理组、Al3++cPTIO处理组,对照组根系SOD活性最低。并且与对照组根部的SOD活性相比,Al3+处理组、Al3++NO处理组、Al3++cPTIO处理组的SOD活性分别升高了72.52%、113.31%、41.64%。由图4-B可知,茶苗茎部的SOD活性在4组处理中具有一定差异,由高到低依次为Al3++NO处理组(107.35 U/g)、Al3+处理组(96.22 U/g)、Al3++cPTIO处理组(65.45 U/g)、对照组(60.87 U/g)。其中,Al3+处理组、Al3++NO处理组的SOD活性显著高于对照组、Al3++cPTIO处理组。Al3+处理组、Al3++NO 处理组与对照组相比,显著提高了58.07%、76.36%,而Al3++cPTIO处理组的SOD活性与对照组无显著性差异。由图4-C可知,茶苗叶片的SOD活性在不同处理组间差异显著,在 Al3++NO 处理下达到最高值145.31 U/g,且显著高于其他3组处理的SOD活性。此外,对照组的SOD活性最低,为 86.40 U/g。Al3++NO处理、Al3+处理(121.96 U/g)、Al3++cPTIO 处理(110.18 U/g)与对照组的SOD活性相比,分别显著提高68.18%、41.16%、27.52%。

研究发现茶苗根系的过氧化物酶活性与SOD活性的变化趋势相同,4组处理间均具有显著性差异(图4-D、图4-E、图4-F)。由图4-D可知,Al3++NO处理下茶苗根系的POD活性最高,为405.09 U/g,相对于对照组(198.50 U/g)提高104.08%,而Al3+处理组(359.38 U/g)、Al3++cPTIO处理组(309.03 U/g)与对照组相比分别提高81.05%、55.68%。茶苗茎部的POD活性在4组处理中均具有显著性差异(图4-B)。由图4-E可知,Al3++NO处理下的POD活性最高,为 134.84 U/g,相比对照组(74.07 U/g)POD活性提高82.04%;Al3+处理(107.06 U/g)、Al3++cPTIO处理(88.54 U/g)比对照组分别提高44.53%、19.53%。茶苗叶片的POD活性在4组处理中均具有显著性差异(图4-F)。Al3++NO处理下的POD活性最高,为319.44 U/g,比对照组(196.18 U/g)提高62.83%。Al3+处理(280.09 U/g)、Al3++cPTIO处理(243.63 U/g)的POD活性也显著高于对照处理,并且分别提高了42.77%、24.19%。

茶苗根系的过氧化氢酶活性在4组处理的不同组织中均表现为Al3++NO处理下达到最高值(图 4-G、图4-H、图4-I)。由图4-G可知,根系的CAT活性同样也在Al3++NO处理下达到最高值,并显著高于其他3组处理,由高到低依次是Al3++NO处理组(144.57 U/g)、Al3+处理组(94.73 U/g)、Al3++cPTIO处理组(76.11 U/g)、对照组(48.31 U/g)。由图4-H可知,茶苗茎部的CAT活性在4组处理中也均具有显著性差异,并且在Al3++NO处理中达到最高值(102.27 U/g),比对照组(28.75 U/g)显著提高255.72%。此外,Al3+处理组(83.18 U/g)、Al3++cPTIO处理组(55.14 U/g)也分别比对照显著提高了189.32%、91.79%。由图4-I可知,茶苗叶片的CAT活性在4组处理中也均具有显著性差异,且4组处理中CAT活性从高到低依次为Al3++NO处理组(128.31 U/g)、Al3+处理组(87.66 U/g)、Al3++cPTIO处理组(67.63 U/g)、对照组(40.06 U/g)。与对照组相比,其他3组处理的CAT活性由高到低依次提高220.29%、118.82%、68.82%。

3 讨论与结论

观察不同处理下茶树不同组织Al3+含量的变化,发现外源添加Al3+促进了茶树根、茎、叶各器官的Al3+累积。马小雪等的研究也表明,外源添加Al3+处理可以不同程度地提高茶叶中的Al3+含量[17]。黄春琼等通过Al3+胁迫处理狗牙根发现,其体内的Al3+含量显著增加,且主要集中在根系[18]。Al3+首先通过抑制植物根尖细胞的伸长和细胞分裂,进而损害根系发育,使植物根系对水分和营养元素的吸收受到限制[19-20]。本研究同样发现茶树根部的Al3+累积量比茎、叶片的更多。此外,外源添加NO显著促进了茶苗各组织对Al3+的吸收,而添加cPTIO均抑制了其对Al3+的吸收。目前有学者发现,无Al3+施加时,外源施加NO对桉树根中Al3+含量没有显著影响,而在Al3+施加的情况下,桉树根系的Al3+含量会随外源NO浓度的增加而不断增加[21]。可见,NO信号分子通过某种途径加重了茶树的Al3+胁迫,而NO清除剂cPTIO则会缓解该胁迫。

NO作为重要的信号分子,在植物种子萌发、叶片生长、根系伸长等生理过程以及生物和非生物胁迫下的病理过程中具有不同的功能[22]。植物在受到生物或非生物胁迫时,均伴随着NO的产生和NOS活性的增加。研究表明,超声波能诱导紫杉细胞积累H2O2和启动程序性死亡,此过程可被NO供体SNP加强,而被NO清除剂cPTIO和NOS清除剂 L-NNA 部分阻断[23]。外源添加NO释放剂确实能大幅度提升茶苗不同组织的NO含量,NOS的活性也得到显著提高;而添加cPTIO会降低不同器官内的NO含量,同时也降低了NOS的活性。但在单独Al3+处理下,除茶苗叶片的NO含量比对照显著增加外,根和茎的NO含量增加量不显著;NOS活性则在不同组织内均有显著提高,这也表明NO含量的升高部分依赖于NOS活性的提高。同时说明,单独Al3+处理虽然显著影响了NOS活性,但只有茶苗叶片NO含量有显著性变化,几乎不影响茶苗根和茎的NO含量;反而是增加NO提高了NOS活性的同时,茶苗Al3+含量增加,使得茶苗遭受的Al3+胁迫加重,因此推测NO通过某种途径影响了Al3+对茶树的胁迫作用。

植物对铝毒性的反应之一是氧化应激,这会导致植物的质膜脂质过氧化,丙二醛是膜脂过氧化的终产物,其含量高低可以反映植物细胞在胁迫中受损害的程度[24-25]。疏再发研究发现,当Al3+浓度大于0.4 mmol/L时,茶树叶片的MDA含量随Al3+浓度的增加而显著增加[26]。低浓度的铝处理有利于茶树的生长,可以降低茶树叶片的MDA含量,但高浓度的铝处理则增加了MDA含量[5]。本研究发现,不仅茶苗叶片的MDA含量在Al3+处理下显著升高,其茎部和根系的MDA含量也在添加外源Al3+处理后增加。同时,发现Al3++NO处理下,茶树根系、茎部、叶片的MDA含量较Al3+处理显著增加。这与周圆的研究结果一致,即与单一铝处理相比,外源添加NO会使饭豆的MDA含量进一步升高[27]。这表明NO信号分子对Al3+胁迫有正向调控作用,也意味着清除NO能够有效缓解外源Al3+对茶树细胞膜脂的氧化损伤。此外,脯氨酸作为植物逆境胁迫的产物,在逆境胁迫下植物体内游离脯氨酸的增加是一个普遍现象,并且脯氨酸的增加有利于植物对逆境胁迫的抵抗,从而在一定条件下增强植物对环境的适应性[28]。已有研究发现铝处理茶树的游离脯氨酸积累浓度是对照含量的2倍[29]。与本试验的结果一致,外源添加Al3+会导致茶苗不同组织的游离脯氨酸含量增加,并且外源添加NO能够导致脯氨酸含量再度上升,而外源添加cPTIO能够降低脯氨酸的含量。脯氨酸含量的多少在一定程度上反映了植物的抗逆性,因此茶苗能通过积累游离脯氨酸减轻Al3+毒害,提高其耐铝性。

植物体内的SOD、POD、CAT活性增加是植物应对外界环境变化时的一种应急解毒措施[30],可以缓解逆境对植物细胞的伤害。已有研究表明,Al3+浓度在 0～0.4 mmol/L范围内,茶树根系的SOD、CAT、POD等酶活性均显著提高[31]。黄丹娟等发现,茶树在铝处理时抗氧化系统的变化一般是提高保护酶的活性,以清除代谢过程中产生的活性氧自由基等毒害物质[32]。本试验同样发现外源添加Al3+显著提高了茶树各组织的抗氧化酶活性,并且发现添加cPTIO能够有效减轻铝对茶树细胞的伤害,因此Al3++cPTIO处理虽然降低了茶树的抗氧化酶活性,但足以应对Al3+胁迫对茶苗带来的氧化损伤。

综上所述,Al3+胁迫对茶苗累积NO的影响小,但NO水平明显可以通过调控茶苗在Al3+胁迫下茶树的Al3+累积、膜脂过氧化程度等介导植株铝积累,加重Al3+毒害。cPTIO则可以在减少NO水平的同时减少植株的Al3+累积。因此,可以考虑通过降低茶树生长环境中的NO而缓解Al3+胁迫对植物的不利影响,但NO清除剂缓解茶树Al3+胁迫的机制仍待进一步研究。

致谢:感谢马月花老师对多功能酶标仪及张盼盼老师对微波消解系统仪器(南京农业大学园艺学院中心实验室)使用的帮助。