陈旧骸骨DNA身份鉴定的法医学进展

陈璐，周喆，王升启

军事医学研究院生物信息中心，北京 100850

牙齿和骨骼组织由于结构特殊而具有很强的抗腐败能力，在许多复杂案例中，如历史人物鉴定、失踪人员调查、重大灾难处理、战争遗骸鉴定等，往往是可用于DNA 分析的唯一生物检材[1-3]。牙齿和骨骼中含有大量无机成分，起到长久保存DNA 的作用，即使检材白骨化或者被破坏，仍可提供DNA 用于检测。同时，这些无机成分使得牙齿和骨骼类样本需要特殊的预处理和提取方法释放和回收DNA。通常情况下，牙齿和骨骼检材的DNA 鉴定步骤包括取材和研磨，脱钙和裂解，DNA 纯化和定量，扩增和片段分析。然而，在实际检案中，死后间隔数年至数十年的骨骼和牙齿在被发掘前，可能已长久暴露在外界复杂的环境中，鉴定人员面临陈旧骸骨DNA 含量极少、高度降解、严重污染、抑制因素干扰等严峻挑战[4-5]。本文综合了近年来的相关研究成果和案例报道，从采集检材、DNA 提取、DNA 富集和检测分析方案等方面进行综述，为法医学陈旧骸骨DNA 研究和鉴定、法医考古分子研究、人类学分子研究等提供参考。

1 骨骼选材

根据国际法医遗传学会（International Society for Forensic Genetics，ISFG）的DNA 委员会针对灾难遇害者身份鉴定的建议[4]，对于跨越数周或更长时间的样本收集或在不利的环境条件下，骨骼和牙齿样本是最可靠的DNA 来源。骨骼和牙齿是自然状态下保留时间最久的生物样本，法医学现场勘验员应根据现场条件判断和选取可以提供更多遗传信息的检材。牙齿是人体内最坚硬的组织之一，完整的牙齿样本封闭性强，微生物群影响低，利于DNA 保存。牙齿选材一般原则为选择非离体、封闭、完整的磨牙[6]。人体共计206 块骨骼，这些骨骼在个体间、不同类型间、同一类型不同部位间DNA 含量和抗降解能力均存在差异[7]。一般情况下，选材以承重部位长骨的致密皮质骨为首选，松质骨可能也含有丰富的DNA，但抗降解能力差，保存DNA 能力有限[4]。

近20 年来，首选长骨作为陈旧骨骼身份鉴定的DNA来源已经成为法医学领域的共识[7-8]。美国武装部队DNA 鉴定实验室（Armed Forces DNA Identification Laboratory，AFDIL）于1994—2004 年处理了约2 000 份二战期间、越南战争期间人类骸骨和牙齿样本，结果显示，承重的长骨（如股骨、胫骨、跖骨）是最好的标本类型，尤其长骨皮质最密集的部分效果最佳。松质骨常因暴露在环境中受到破损和污染，孔隙难以彻底清理，DNA 提取效果不如致密的皮质骨[8]。研究人员比较了股骨和胫骨5 个解剖位置的DNA 回收情况和STR 图谱，包含近端干骺端、近端骨干、骨干中段、远端骨干和远端干骺端，结果显示，股骨的DNA 回收率明显高于胫骨，其中股骨中段和远端骨干可得到完整的STR 图谱[9]。一些死后间隔时间较短的骨骼鉴定意见支持首选松质骨[7,10]。MUNDORFF 等[10]从3 具白骨化的骸骨中提取55 个骨骼部位的DNA，比较单个个体骨骼样本不同位置的DNA 产量，结果发现，小的松质骨平均每单位质量骨粉产生的DNA 数量比致密的皮质骨高得多，该结果在另外10 例骨骼样本中也得到支持，该研究所用样本为死后3～21 年骸骨。另一项对死后间隔4 年的49 例不同类型骨骼的研究[7]结果表明，足部的小型松质骨优于其他类型，认为这可能是由于骨骺线间的软组织残留物在细菌所形成的生物膜下保存良好，使得DNA 未被降解[2]。综合文献，当仅考虑死后间隔时间时，如死后间隔大于50 年，首选长骨的骨皮质回收DNA，如死后间隔小于20 年，松质骨更佳。

随着各类疑难案例中陈旧骨骼样本鉴定需求的增加，陈旧骨骼DNA 高度降解、严重污染成为DNA 检测的最大挑战。借鉴古人类DNA 研究，人类颞骨岩部作为鉴定检材逐渐被法医学界引入和尝试[2,11-14]。颞骨岩部位于颅底蝶骨和枕骨之间，是哺乳动物体内最硬和最致密的骨骼[15]。2014年，GAMBA 等[16]分析了13例意大利考古遗址挖掘的遗骸（从公元前5700年到公元前800 年）中颞骨岩部、牙本质、股骨、肋骨、掌骨和跖骨的内源性DNA 产量，结果显示，颞骨岩部DNA产量最高，更适合降解样本，认为这可能与高密度颞骨岩部导致细菌介导的DNA 减少有关[17]。PINHASI等[18]进一步比较了颞骨岩部3个区域的内源性DNA 产量，即小梁骨的海绵部分、环绕骨质内耳的皮质骨致密部分和耳囊内致密部分，结果发现，耳囊内DNA数量为环绕骨质内耳的皮质骨致密部分的65倍，为小梁骨海绵部分的177倍。最近，有研究[2]分析了3具完整的第二次世界大战期间骸骨，得到了相同结果，即所有骨骼中颞骨岩部耳囊内致密部位的DNA 产量较高。该研究团队还认为，第三掌骨和跖骨DNA 回收效果良好，取样简单，减少了潜在的DNA 污染，在发掘的骸骨样本较完整时可以采用[13]。当生物检材极难获取时，除上述骨骼类型外，第一肋骨近端或椎体末端[19]，第12 胸椎的板层和棘突处[20]，脚部楔形骨、远端脚趾骨、距骨[21]等也被证实可用于骸骨DNA 鉴定，而颅骨碎片可能最难获得有效序列数据[8]。

综上所述，陈旧骸骨检材选取股骨、胫骨承重骨的皮质部位提取DNA 效果最佳，并且方便识别、保存和运输。在有完整颅骨检材时，采集颞骨岩部也是值得推荐的选择。当以上骨骼部位均不可采集时，椎骨、距骨、掌骨等均有采集价值。

2 DNA 准备

2.1 DNA 提取

人类骨骼组织主要由骨细胞、成骨细胞和破骨细胞组成，其细胞间质主要由胶原和羟基磷灰石构成，胶原约占骨质量的30%，羟基磷灰石约占骨干质量的65%～75%[22]。因此，骨组织抗腐败降解能力强但同时高度钙化增加了骨组织DNA 的回收难度。理想的骸骨DNA 提取效果是消耗少量骨粉获得高质量DNA。因此，DNA 提取过程应尽量减少和简化提取步骤，以避免DNA 的进一步降解和污染，从而实现DNA 提取快速、高效、简便、纯净。传统的骨骼、牙齿DNA 提取方法主要分为去矿物质、裂解和纯化三步。去矿物质又称脱钙，其基于一个前提，即DNA 被紧密地结合在密集的骨结晶聚合体中，没有脱钙处理，DNA 就不会被释放到溶液中[23]。样本脱钙后，利用蛋白酶K 裂解细胞释放DNA，最后以过滤柱[8,24]、磁珠[25-26]纯化回收DNA。

经典的骨骼DNA 提取方案[8]为向1～2 g 骨粉中加入3 mL 提取液[10 mmol/L Tris，pH=8.0；100 mmol/L NaCl，50 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra-acetic acid，EDTA），pH=8.0；0.5%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）]和100 µL 20 mg/mL蛋白酶K，充分混匀后56 ℃轻轻振荡过夜。次日，利用有机溶剂（V苯酚：V氯仿：V异戊醇=25∶24∶1）进行DNA 纯化和浓缩。但此方法不能完全去除矿物质，即非完全脱钙法，且其孵育过程中需要更换脱钙液或脱钙后移取上清液，增加了操作步骤且易损失DNA。因此，LOREILLE 等[27]提出完全脱钙法，即每克骨粉中加入15 mL 提取液（0.5 mol/L EDTA 和1%月桂醇-肌氨酸钠）和200 µL 20 mg/mL 蛋白酶K，至骨粉完全物理溶解后采用有机试剂法回收DNA。该方法较非完全脱钙法的DNA 提取率平均提高约4.6 倍[28]。SEO 等[24]利用上述DNA 提取方法，通过比较2 mL 和9 mL 的脱钙液，结果同样支持完全脱钙处理能够回收更多DNA。董慧婷等[29]比较了不同浓度EDTA 脱钙液对骨骼DNA的提取效率，结果表明，0.5 mol/L EDTA 在3～24 h内效率均最高。研究[24]发现，QIAquick®离心柱不仅回收更多DNA，并且含PCR 抑制物少，STR 分型效果更好。Qiagen MinElute 柱提法试剂盒作为一种骨骼DNA 纯化方案，旨在回收高质量DNA 的同时，降低脱钙液中抑制剂的干扰。但有研究[30]报道，Qiagen MinElute 柱提取DNA 损失率为21.75%～60.56%，且不擅长回收较小片段。

近年骨骼和牙齿DNA 提取方案在快速、高效方面也取得了进步。LIU 等[31]提出了一种简便快速的有机试剂提取和磁珠回收骨骼DNA 方案，该方案在6 h内可以完成1 g 陈旧骨粉DNA 提取，大大缩短了骨骼DNA 的提取时间。美国Promega 公司新研制的骨骼脱钙缓冲液可在4 h 内成功提取25 mg 新鲜骨粉DNA，如果配合自动DNA IQTM工作流程将提高提取效率[31]。PrepFilerTMBTA 法医DNA 提取试剂盒是美国Applied Biosystems 公司专门为处理具有挑战性的法医学样本（如骨头、牙齿、烟头、口香糖、信封盖和磁带等）而设计，被广泛采用[32-34]。该方法一次最大样本量为50 mg 的骨粉或牙粉，经PrepFilerTMBTA 法医DNA 提取试剂盒裂解，1.0 mol/L 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）和蛋白酶K 混合混匀，在56 ℃孵育2 h 后，即可进入磁珠结合、洗涤、洗脱步骤。该方法相较传统的脱钙提取法，大大减少了孵育时间，并且在大样本量提取需求时结合工作站，可以实现自动化提取，如利用PrepFilerTMBTA 法医DNA 提取试剂盒和AutoMate ExpressTM系统[35-36]，可在3 h 内完成骨骼DNA提取。

2.2 DNA 修复

随着大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS）技术检测低水平变异频率的阈值降低，死后50 年以上的陈旧骸骨DNA 被证明存在干扰后续遗传标记检测及其结果解释的损伤[37-38]。考古学中，骸骨DNA 常见胞嘧啶脱氨损伤，即C→T、G→A改变。有研究[39]证明，这类DNA 损伤中的尿嘧啶可以被尿嘧啶-N-糖基化酶（uracilN-glycosylase，UNG）有效去除。NEBNext 甲醛固定和石蜡包埋组织DNA 修复试剂盒不仅可以切除脱氨氮胞嘧啶残基，还可以修复双链DNA（double-stranded DNA，ds-DNA）以保留用于PCR 的长片段。未经处理的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）PCR 扩增子序列中检见高达850 个因胞嘧啶脱氨导致的C→T、G→A改变，而经该试剂盒修复的DNA 结果中此类变异降低为10 个[37]。PreCRTM修复混合液可以修复氧化性损伤DNA 和紫外线照射性损伤DNA，表现为修复后DNA 的STR 检测信号增加。但是在陈旧骸骨DNA 上绝大多数基因座检测信号却减少了，表明骸骨样本可能包含多种类型损伤，而PreCRTM酶只适用于双链构象DNA[40-41]。综上，损伤DNA 修复既可以产生更好的检测结果以帮助结果解释，还可以节省样本和反复实验的消耗成本，可以在实践中考虑使用。

综上所述，陈旧骸骨DNA 提取关键在于降低污染和最大程度回收DNA。当样本条件差时，取0.5～1 g骨粉单次提取可以减少样本暴露和转移，采用完全脱钙处理能够尽可能释放残余DNA，最后可经过柱提法或磁珠法纯化回收。当样本数量众多且保存条件尚可时，可以采用PrepFilerTMBTA 法医DNA 提取试剂盒，骨粉投入量小（25 mg），且结合磁珠法能够实现批量自动化提取，效率高。此外，DNA 修复处理能够在一定程度上提高某类损伤DNA 的鉴定结果质量，建议用于陈旧骨骼DNA 个体识别鉴定。

3 目标片段分析方法

陈旧骸骨检材的个体识别鉴定策略包括片段分析和序列分析。片段分析即特定遗传标记检测，如STR、miniSTR、SNP 等；序列分析指测序获得样本部分或全部序列信息，如Sanger 测序mtDNA 高变区序列。由于陈旧骸骨内源性DNA 数量有限且常伴随DNA 降解和损伤，为获取足够可信的DNA 分型数据需要在检测前进行目标DNA 片段富集。常用的DNA片段富集方法为多重PCR 技术和杂交捕获技术，不同的富集技术需要结合特定的检测方法。本部分重点介绍以下几种富集技术与检测方法的组合及应用。

3.1 多重PCR-毛细管电泳

多重PCR 技术可以同时扩增成百上千条特定序列，高效利用有限的DNA，同时兼容多种遗传标记，如STR、miniSTR、SNP 等，适用于高度降解DNA。目前，基于毛细管检测平台的商品化STR 身份鉴定系统在陈旧骸骨DNA 鉴定案例中仍为首选。早期案例中通常联合多种STR 遗传标记以增加检出的基因座，如2015 年，10 例二战期间位于波斯尼亚和黑塞哥维那的遗骸样本经15 个常染色体STR 和23 个Y-STR 分型，其中9 例获得有价值的常染色体STR 图谱，成功用于死后70 年的受害者身份鉴定，亲属匹配率达60%[42]。另1 例报道[34]中，335 名意大利人在二战期间于罗马附近被德国纳粹屠杀，法医专家小组经过多种STR 基因座分型，确认了其中323 名受害者（成功率为96.42%）。1990—2018 年，AFDIL 对2 177 份骸骨和1 656 颗牙齿进行了分析鉴定以寻找战争中失踪的美军人员，主要依靠联合应用多重扩增常染色体STR、Y-STR、miniSTR、mtDNA 等遗传标记[5]。2021 年，鉴定人员采用21 个常染色体STR 和23 个Y-STR 分型，完成了2 例土埋40 余年股骨的亲权鉴定分析[43]。

2021 年以来，多项陈旧骸骨鉴定研究[7,20,44]采用美国Thermo Fisher Scientific 公司推出的六色荧光标记试剂盒GlobalFilerTMPCR 扩增试剂盒[45]，其包含所有DNA 联合索引系统（combined DNA index system，CODIS）基因座、欧洲常用STR 和10 个miniSTR，不仅具有全球DNA 数据库兼容性，还专门针对降解DNA、痕量DNA 和低水平DNA 样本。因此，GlobalFilerTMPCR 扩增试剂盒作为单个STR 鉴定系统，因涵盖多种STR 基因座且便捷省时成为热门选择。此外，ZUPANIČ PAJNIČ 等[44]尝试用高通量测序技术检测GlobalFilerTMPCR 扩增试剂盒中的基因座序列，不仅提高了单独应用毛细管电泳分型无法获得的图谱比例，还发现了多个序列杂合性等位基因。值得注意的是，陈旧的骨骼和牙齿检材通常携带环境微生物，从而产生微生物来源伪峰，这类伪峰在骨骼和牙齿的STR 图谱中并不罕见[46]，因此，正确认识此类现象并且准确解释STR 图谱非常重要。

3.2 mtDNA 扩增-Sanger 测 序

mtDNA 拷贝数目多、结构稳定、高突变区变异频率高，是检测微量、高度降解骸骨和牙齿样本的常用遗传标记。mtDNA 具有母系遗传特点，常与STR、SNP 遗传标记联合使用，起到排除或不排除母系关系的作用。鉴定应用中，通常扩增和测序mtDNA 的高变区（hypervariable region，HV）Ⅰ、HVⅡ 2个片段便可以得到理想效果，如斯洛文尼亚的万人坑中，88例受害者残骸中的HVⅠ和HVⅡ检出率分别达到95%和98%，这些残骸距身份鉴定已间隔65 年（1945—2010 年）[47]。俄国沙皇遗骨鉴定案例中，骸骨在死后73 年被发现，英国法庭科学服务部通过比对每具骸骨的mtDNA 控制区740 bp 序列和俄皇后母系直系后裔曾外甥的mtDNA 序列，确证了骸骨的皇族成员身份[48]。mtDNA检测灵敏度极高，实验过程中建立完整的防污染系统规范十分重要，如实验区域的绝对清洁，实验前后充足的消毒灭菌处理，实验人员完备的防护措施，实验各个阶段添加阳性和阴性对照品，PCR 前后分区域进行操作以及DNA 质量控制数据库等。

3.3 下一代测序

3.3.1 STR 和SNP

高通量测序技术又称下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）能够同时检测STR 基因座的长度多态性和序列多态性，可兼容STR、SNP 多种遗传标记，同时测序多个样本，使得鉴定效率得到很大的提高。目前，美国Verogen 公司推出的ForenSeqTMDNA Signature Prep 试剂盒在高通量鉴定应用中占主导地位[49]，最多可检测230 个基因座，涵盖27 个常染色体STR、24 个Y-STR、7 个X-STR、94 个个体识别SNP、22 个表型SNP 和56 个生物祖先SNP，其中绝大多数基因座产物长度小于200 bp，非常适合陈旧骸骨和牙齿高度降解样本的鉴定。ZHANG 等[50]通过模拟痕量和降解样本实验得出，ForenSeqTMDNA Signature Prep 试剂盒在DNA 模板为50 pg 或样本高度降解[降解系数（degradation index，DI）为72.28]时，可以检出大于80%的等位基因。SHARMA 等[51]使用一系列降解DNA 样本和24 个种类为骨骼、血卡和牙齿的模拟案件样本测试ForenSeqTMDNA Signature Prep 试剂盒。两组连续降解的DNA 样本结果显示，当DI>4 时，STR 开始丢失。丢失的位点主要是具有长扩增子以及低读数（覆盖率）的基因座，如PentaE、DXS8378和rs1736442。然而，严重降解的DNA（DI 为44）仍能获得18 个CODIS 基因座（占比90%）。作者模拟的多种类型案件样本与上述降解DNA 样本结果相符[51]。研究[51]表 明，ForenSeqTMDNA Signature Prep 试剂盒可以成功用于降解DNA 样品。同年，在南非开普敦海岸发现的腐烂的人类下肢和手鉴定案例中，采用ForenSeqTMDNA Signature Prep 试剂盒高通量测序，确认了2 份检材来自同一个体，协助遗体的识别和认亲。该案例是全球首次采用高通量测序方法从海洋分解的软组织裂解物中获得完整DNA 的报道[52]。

3.3.2 mtDNA 全序列

基于高通量测序平台，美国Thermo Fisher Scientific 公司的精准身份识别mtDNA 全基因组试剂盒[53]包含162 对多重扩增引物，以平铺方法覆盖整个线粒体基因组。这些引物对平分于2 个离心管，扩增子平均长度为163 bp，起始DNA 低至2 pg，专门针对高度受损、降解的牙齿和骨骼样本。该线粒体基因组高通量测序试剂盒已经被验证效果良好[54-55]。

3.3.3 杂交捕获

自2010 年以来，杂交捕获在法医学领域获得了关注。杂交捕获的主要优势是适用于降解DNA，没有PCR 引物对数限制及可能的错配和污染[56]。杂交捕获通常是在提取的DNA 模板进行基因组库制备后引入的，以便富集mtDNA 或核基因组内的目的片段，应用MPS 生成DNA 序列[56]。在陈旧、降解的骨骼样本中，内源性人类DNA的比例可能非常低，而杂交捕获技术能成功应用于含有少于1%内源性DNA、平均长度仅为70 bp 的古人类DNA 鉴定中[57]。在法医学研究中，杂交捕获方案首先被应用于陈旧样本的mtDNA序列鉴定[58-59]。例如，TEMPLETON 等[60]应 用DNA 探针捕获技术检测7 例二战期间（约70 年）和考古样本（约2 500 年）中的骸骨样本，经2 轮杂交捕获得到了近100%的线粒体基因组覆盖率，成功在5 例样本中获得线粒体基因组图谱。BOSE等[61]提出了最早用于法医学样本检测的SNP捕获体系之一，该体系含451个遗传标记，即375 个SNP 和36 个微单倍型，其在模拟降解样本上表现良好，相比于PCR 富集，SNP 回收率有所提高。对于片段长度≤75 bp 的样本，该体系使用0.5 ng DNA 可以分析98%以上的SNP，回收片段小至25 bp，非常适用于高度降解的DNA 检测[61]。GORDEN 等[62]构建了25 000 个和95 000 个SNP 捕获体系，用于14 例死后75 年骸骨样本共计21 对亲缘关系鉴定，分别成功鉴定出16 和17 个成对的亲缘关系，包括亲子、全同胞、祖孙、叔侄、祖侄关系等。杂交捕获对于STR 富集具有可尝试性[63]，但效果不佳。值得注意的是，目前杂交捕获技术灵敏度欠佳，成本高，使用者工作强度大。

3.4 基因芯片

基因芯片可以同时检测多个样本的多个遗传标记，具有快速检测的特点，在高通量测序早期阶段应用较多。2014 年，针对济州特别自治道大规模陈旧骸骨（1948 年遇难者）鉴定需求，韩国法医学专家开发了一个基于美国Affymetrix 公司重测序阵列平台的169 个个体识别SNP 检测芯片，测试结果显示，该芯片中120 多个SNP 能够在低至约10 pg 的DNA 样本和人工降解样本中获得分型[64]。济州特别自治道402具骸骨的鉴定过程中，该芯片作为SNP 分型的补充工具，在74 具可得STR 图谱的基础上增加检出了51 具骸骨的分型，为STR 数据不足的样本增加了遗传信息[65]。

综上所述，多重PCR-CE 技术及结果解释规范、成熟，产品丰富，效果稳定，在全球法医实验室普遍适用，且数据量积累庞大，便于开展陈旧骸骨DNA 个体识别及比对工作，因此，当前及短期内陈旧骸骨的DNA 鉴定仍将以多重PCR-CE 技术为首选。为了从微量的陈旧骸骨DNA 中解析更多个体的遗传信息，基于高通量测序技术的研发正在快速发展并逐渐成为取代CE 技术的强有力手段。此外，高通量测序技术低成本化发展且可以融合更多创新技术，越来越多新技术的引入也将促进高通量测序在陈旧检材鉴定中的作用。测序前片段富集方面，多重PCR 虽然存在引物对容量和平衡的问题，但从技术便捷性和成熟性方面考虑，仍然具有压倒性优势，而杂交捕获技术则需要进一步优化过程，降低成本。

4 展 望

近5 年，随着高通量测序技术逐渐低成本化以及多学科间交叉融合研究和发展，陈旧骸骨DNA 检测技术不断被探索和完善，可检测的骨骼类型丰富，DNA 回收量和回收率提高，靶向型高通量测序体系快速发展。综合相关研究和案例，在陈旧骨骼鉴定中，选取长骨样本成功率高，DNA 提取时确保完全钙化并减少液体转移步骤，有利于DNA 回收。目的片段富集以多重扩增技术为主，结合高通量测序平台，是目前实现陈旧骨骼高效检验的最优组合。值得思考的是，骸骨的保存状态对DNA 检验起到决定性作用。骸骨被发掘前的保存环境十分复杂，如温度、湿度、酸碱度、深度、微生物集群等，这些外界环境因素对骸骨DNA 的影响和关联性有待进一步研究。此外，目前骨骼DNA 采样部位通常是根据鉴定人员经验来决定，有时会对保存较差的骸骨样本造成较大甚至不可逆的破坏性。如果能够加入影像学手段，如CT[66]和X 射线以帮助判断骨骼或牙齿状态，有针对性地选用适量体积，可以在解决骸骨DNA 鉴定的同时对骸骨进行最大程度的保护。此外，陈旧骸骨的DNA 分析中，如何把握分型结果的准确性十分重要。如上文所描述，陈旧骸骨DNA 分型图谱可能存在微生物引入的伪峰，当DNA 高度降解且为痕量，测序会出现次要等位基因未达阈值的假阴性现象等。本文综述了当前骨骼和牙齿DNA 检测的主要技术，特别针对陈旧降解骸骨，为相关人员的应用和研究提供参考。