PI3Ks 新型抑制剂NVP-BEZ235 对食管鳞癌的抑制作用*

姚佳仪，王斯琦，钱玉兰，孙晓鸣，马 赛，杨 薇，郭 冰，杨 中，查良英

（1. 苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006； 2. 江苏省苏州市第五人民医院，江苏 苏州 215131；3. 江苏省苏州市广济医院，江苏 苏州 215131； 4. 南京医科大学附属苏州医院，江苏 苏州 215008；5. 江苏省苏州高新区人民医院，江苏 苏州 215129）

食管癌是人类常见的恶性肿瘤，我国发病率和病死率分别居全球第6位和第4位，严重威胁国民健康［1］。食管癌在组织病理学上主要分为食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）［2］，我国以食管鳞癌为主，占食管癌的90%。目前，食管鳞癌的发病机制尚不完全清楚，其治疗仍以手术为主，辅以放射治疗和化学治疗，临床缺乏有效的分子靶向药物，患者5年生存率极低［3］。因此，探索新的靶向治疗药物对食管鳞癌的治疗十分重要。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）是一种位于胞内的磷脂酰肌醇激酶家族，在细胞的增殖、分化和胞内运输中具有关键作用［4-5］。PI3Ks 根据其编码基因和催化底物，可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3 种类型。Ⅰ类亚型的PI3Ks 为异源二聚体，由1 个110 000 催化亚单位（p110α，由位于3q26.3 的PIK3CA 编 码）和1 个85 000 调 节 亚 单 位（p85α，由位于5q13.1 的PIK3R1 编码）组成［6］。PIK3CA在食管鳞癌中存在高频突变和扩增，其表达与淋巴结转移相关［7-8］。磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基p85α抗体（PI3K-p85α）的基因多态性与食管鳞癌的风险增加有关［9］。有研究指出，lncRNA LINC01503 可诱导PI3K -p85α 的激活而促进食管鳞癌细胞的增殖［10］。NVP -BEZ235（Dactolisib）是一种新型的PI3Ks 和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）双重抑制剂，对肝癌、甲状腺癌等均显示出良好的抑制作用［11-12］。本研究中主要通过体内外模型探讨了NVP-BEZ235 对食管鳞癌的作用，以及PI3K -p85α 表达水平对NVP-BEZ235 效果的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药、动物与细胞

仪器：Thermo 240 型CO2培养箱，Thermo Varieskan LUX 型酶标仪，均购自（美国Thermo Revco 公司；Olympus Ⅸ51型倒置显微镜（日本Olympus公司）。

试药：RPMI 1640 培养基（美国Gibco 公司，批号8122282）；胎牛血清（法国Biowest公司，批号为S1700）；NVP - BEZ235（Dactolisib，Med Chem Express 公司，批号20210712）；四甲基偶氮唑盐（MTT，批号为HY -15925），二甲基亚砜（批号HY - Y0320），均购自Med Chem Express 公司；吉姆萨染液（北京索莱宝科技有限公司，批号为G1015）；PI3K-p85α（批号为60225-1-Ig），甘油醛- 3 - 磷酸脱氢酶抗体（GAPDH，批号60004 -1 - Ig），均购自美国Proteintech 公司；BCA 检测试剂盒（批号为P0012S），0.25%胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸（Trypsin - EDTA，批号为C0201），放射免疫沉淀分析裂解液（RIPA，批号为P0013B），上样缓冲液（Loading Buffer，批号为P0015），聚偏二氟乙烯膜（PVDF，批号为FFP28），脱脂牛奶（批号为P0216），均购自上海碧云天生物科技有限公司；发光液（苏州阿尔法生物实验器材有限公司，批号为180-5001）。

动物：6 周龄雌性BALB/c-nu 裸鼠10 只，购自杭州子源实验动物科技有限公司，生产许可证号SCXK（浙）2019 - 0004，使用许可证号SCXK（苏）2022 -0008。动物实验经江苏省苏州市第五人民医院伦理委员会批准［批件号为（2022）院伦理审字（10）号］。饲养条件为，SPF 级动物房，温度23～25 ℃，相对湿度（50±10）%，12 h/12 h 明暗交替。

细胞：食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE70、KYSE510、KYSE410、 TE1、 KYSE150、 KYSE180、 KYSE270、KYSE450 均购自中国科学院细胞库；食管腺癌细胞系OE33、OE19、ESO26 由美国南加州大学De-chenLin 教授惠赠。

1.2 方法

细胞培养：在37 ℃、5%CO2条件下，用含10%胎牛血清的1640培养基培养食管癌细胞系，隔天换液。每个细胞系给予0，1，4，8，16，32，64，128 nmol/L 浓度梯度的NVP-BEZ235培养48 h。

细胞增殖能力检测：采用MTT 比色法。取对数生长期细胞，接种于96 孔板中，每孔6 × 103个，在37 ℃、5% CO2条件下培养。每个细胞系给予0，1，4，8，16，32，64，128 nmol/L NVP-BEZ235 培养48 h。加入MTT（每孔20 μL），继续培养4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO，每孔200 μL）振荡10 min。以酶标仪于570 nm波长处测定吸光度（OD），平行测定3 次，并计算细胞生存率。细胞生存率（%）=OD用药组/OD对照组× 100%。以增殖率为50%时的药物浓度为半数抑制浓度（IC50）。

细胞集落形成实验：取对数生长期细胞，接种于24孔板中，每孔1×103个，在37 ℃、5%CO2条件下培养4 d。当培养皿中出现肉眼可见克隆时，给予10 nmol/ L NVP-BEZ235培养48 h。弃去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）小心浸洗2 次，空气干燥。甲醇固定15 min，弃甲醇，空气干燥。用吉姆萨染液染色10 min，用流水缓慢洗去染液，空气干燥。

细胞表达检测：采用免疫印迹（Western blot）法。在T25瓶中收集肿瘤细胞，计数2×106细胞，离心（转速为1 500 r/min）5 min，加入300 μL RIPA 裂解液，4 ℃冰浴10 min，超声5 min，离心（转速为12 000 r/min）10 min，采用BCA 法测定蛋白质浓度，加入Loading Buffer 煮沸5 min。冷却后上样（30 μg蛋白/泳道）。100 V、60 min进行转膜，将胶上的蛋白转移到PVDF 膜上，并在室温条件下用牛奶封闭1 h，加入p85α 抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；次日用TBST 洗脱3 次，每次15 min；加入二抗孵育1 h。加入显影检测试剂与膜蛋白充分混匀，室温孵育5 min，用凝胶成像仪曝光并拍照。

裸鼠移植瘤实验：6周龄雌性BALB/c-nu裸鼠10只，KYSE30 肿瘤细胞1×106个/只接种于裸鼠上肢腋下。每10 d 测量皮下移植瘤的长度和宽度，计算肿瘤体积，体积= 1/ 3 ×（长度× 宽度× 宽度）。待肿瘤体积达到100 mm3时，将裸鼠随机分为实验组和对照组，每组5 只。实验组腹腔注射NVP-BEZ235（10 mg/kg），每周2 次；对照组注射PBS。第50 天使用CO2法处死小鼠，剥取肿瘤组织，称定质量并拍照。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计学软件分析。计量资料以±s表示，行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌细胞系中PI3K-p85α 表达

食管鳞癌细胞系中KYSE30，KYSE70，KYSE510，KYSE410，TE1，以及食管腺癌细胞系OE33 和OE19 中PI3K - p85α 表达均较高；食管鳞癌细胞系KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450，以及食管腺癌细胞系ESO26中PI3K-p85α的表达量较低。详见图1。

图1 食管鳞癌细胞系中PI3K-p85α表达量Fig.1 Expression of PI3K-p85α in ESCC cell lines

2.2 对食管鳞癌细胞系增殖能力的影响及IC50

结果显示，高浓度处理后，细胞的增殖能力均显著下降，每个细胞系IC50差异显著。PI3K-p85α 高表达的食管鳞癌细胞系对NVP-BEZ235 的敏感度更高，抑制效果较好，KYSE30，KYSE70，KYSE510，TE1的IC50分别为4.92，5.43，4.76，7.78 nmol/L；PI3K - p85α 表达量较低的食管鳞癌细胞系对NVP-BEZ235的敏感度低，抑制效果较差，KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450的IC50分别为13.21，18.44，20.37，48.45 nmol/L。详见表1。由图2 可知，在加入10 nmol/ L NVP - BEZ235 处理的细胞集落形成实验中，KYSE30，KYSE70，KYSE510，TE1 的集落数目少于KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450的集落数目。

图2 NVP-BE235对食管鳞癌细胞系IC50及集落形成的影响A.IC50 values of ESCC cell lines exposed to different concentrations of NVP -BEZ235 B.Colony formation assay of ESCC cell lines treated with 10 nmol/L of NVP-BEZ235Fig.2 Effect of NVP-BEZ235 on IC50 values and colony formation of ESCC cell lines

表1 NVP-BEZ235对食管癌细胞系细胞增殖的影响（±s，n=4）Tab.1 Effect of NVP-BEZ235 on cell proliferation of ESCC cell lines（±s，n=4）

注：与0 nmol/L比较，*P ＜0.05。Note：Compared with those at 0 nmol/L，*P ＜0.05.

序号1 2 3 4 5 6 7 8浓度（nmol/L）0 1 4 8 16 32 64 128 KYSE30 100.00±10.23 95.13±10.34 70.15±7.45*11.01±6.12*9.92±7.34*3.56±3.32*2.63±2.28*1.86±1.23*KYSE150 100.00±10.34 80.83±8.78*68.05±7.45*64.46±7.64*54.50±5.12*34.34±3.37*15.34±1.76*7.64±0.89*KYSE70 100.00±12.12 86.76±8.56 62.60±6.79*32.12±3.42*23.78±3.87*17.98±1.84*9.67±0.75*4.32±0.43*KYSE510 100.00±9.79 88.37±8.87 52.90±5.67*34.06±3.47*19.41±2.01*16.77±1.72*11.02±1.23*7.25±0.82*TE1 100.00±9.01 91.55±9.13 72.88±7.45*43.32±4.56*31.87±3.41*15.91±1.52*9.96±0.98*5.50±0.45*KYSE180 100.00±9.87 98.64±9.65 75.71±8.03*69.22±7.12*54.55±6.34*38.38±4.12*22.14±2.78*15.09±1.68*KYSE270 100.00±10.21 90.94±9.42 88.86±8.91 74.46±7.82*55.72±5.71*35.23±3.52*22.92±3.91*14.87±1.52*KYSE450 100.00±11.39 94.36±9.21 88.67±8.38*81.15±8.31*74.24±7.31*65.54±6.73*48.74±5.01*19.14±2.13*

2.3 对食管鳞癌细胞系裸鼠皮下移植瘤生长能力的影响

腹腔注射NVP-BEZ235的荷瘤裸鼠皮下移植瘤见图3 A。实验组的移植瘤体积为（531.98±37.14）mm3，显著低于对照组的（1 169.5 ± 110.34）mm3（t= 12.24，P＜0.001）。实验组的移植瘤质量为（0.37±0.10）g，显著低于对照组的（0.91±0.08）g（t=9.51，P＜0.001）。详见图3 B和图3 C。

3 讨论

我国是食管鳞癌的高负担国家，过量饮酒、吸烟等对食管造成损伤的各类慢性刺激及环境因素是中国食管鳞癌发病的主要原因［13-14］。过去几十年，不同于肺癌等其他肿瘤，食管鳞癌在靶向治疗方面发展缓慢，5年生存率改善程度低，亟需在食管鳞癌治疗靶点发现和抑制剂探索方面进行深入研究［3，15］。

肿瘤靶向药物主要是利用肿瘤细胞与正常细胞间分子生物学上的差异（癌基因的突变激活或异常高表达）而抑制肿瘤细胞生长，促进其凋亡坏死，同时降低对正常组织的损害［16］。NVP - BEZ235 是一种 新 型PI3K /mTOR 双重抑制剂，其化学成分是咪唑并喹啉类的小分子合成物，NVP-BEZ235 可与PI3K 和mTOR 激酶的ATP结合口袋结合，抑制其激酶活性［17］。有研究表明，NVP-BEZ235在非小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤等肿瘤中均能产生有效的抗肿瘤活性［12，17-19］。NVP-BEZ235 可诱导p21 基因表达而阻滞细胞周期［20］。NVP-BEZ235 还可通过抑制mTORSer2448位点的去磷酸化下调mTOR 的活性，进而抑制AKTSer473位点磷酸化，最终诱导细胞凋亡［18，21］。本研究中探讨了NVP - BEZ235 对食管鳞癌细胞系的抑制作用，结果发现4 nmol/L NVP-BEZ235便可对肿瘤细胞产生明显抑制，提示NVP-BEZ235 对食管鳞癌的细胞增殖抑制效果良好。

Ⅰ型PI3K分为ⅠA型（p110α，p110β，p110γ）和ⅠB型（p110δ），其中由p110α 和p85α 组成的ⅠA 类PI3K 是目前研究最广泛的类型，主要参与细胞生长、胰岛素信号转导和葡萄糖代谢［5］。p85α 由5 个结构域构成。SH3（Src homology 3 domain）结构域、GAP 结构域（a Rac binding domain flanked by two proline - rich domains，nPRD and cPRD）、N- 端SH2（nSH2）结构域、SH2间（iSH2）结构域和C-端SH2（cSH2）结构域组成。p85α 的主要功能是稳定和结合抑制p110α。p85α 的iSH2结构域与p110α 的结合对p110α 的蛋白稳定性十分重要。但当细胞受到胞外刺激时，nSH2与cSH2结构域可和酪氨酸激酶受体及接头蛋白中磷酸化的酪氨酸结合，破坏iSH2结构域对p110α 的接触抑制，从而促进p110α 催化亚基的激活，最终引起PI3K激酶活化［22-24］。据报道，通过免疫组织化学技术检测了590 例石蜡包埋的食管鳞癌肿瘤组织中PI3K-p85α 蛋白的表达，发现57.1%的肿瘤组织高表达PI3K-p85α，且PI3K-p85α的高表达与不良预后显著相关［25］。本研究结果表明，PI3K -p85α 的高表达可显著提高NVP - BEZ235 对食管鳞癌细胞的抑制作用。在食管鳞癌细胞系KYSE30，KYSE70，KYSE510，TE1 中，10 nmol/ L NVP - BEZ235具有明显的抑制作用。而PI3K-p85α 相对低表达的食管鳞癌细胞系KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450对NVP-BEZ235 的敏感度较低。裸鼠移植瘤实验结果表明，腹腔注射较低剂量（10 mg/kg）的NVP-BEZ235促使移植瘤体积明显缩小，表明NVP-BEZ235 对食管鳞癌体内模型的疗效较好。

综上所述，较低剂量（10 mg/kg）NVP-BEZ235 可在细胞系模型和裸鼠皮下移植瘤中抑制食管鳞癌细胞的增殖，且PI3K - p85α 高表达可显著增强NVP -BEZ235对食管鳞癌细胞的抑制作用。