二甲双胍对急性肺损伤细胞凋亡、迁移和上皮-间质转化的影响及机制研究

欧阳运萍，陈涛，李鹏，赵博，杨小军

急性肺损伤属于临床严重呼吸系统疾病之一，具有高发病率和高死亡率，是临床许多危重疾病患者发生急性呼吸衰竭的重要原因［1］。目前，临床上急性肺损伤的治疗手段对于提高患者生存质量效果不佳，因此寻求治疗急性肺损伤的有效手段具有重要意义。二甲双胍是临床广泛用于治疗糖尿病的药物，其疗效及安全性已得到充分证实。研究发现，二甲双胍在减轻肺损伤方面具有一定作用［2］，包括对脂多糖诱导的急性肺损伤［3］。但二甲双胍对氧化应激造成急性肺损伤的作用机制研究较少。既往研究显示，二甲双胍与p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信号通路关系密切［4］。p38 MAPK是人体关键细胞内信号通路之一，可参与多种呼吸系统疾病的发生与发展［5］。近年来有p38 MAPK信号通路与急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等常见呼吸系统疾病相关的报道［6］。另有研究显示，p38 MAPK信号通路参与了上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）进程［7］。Ⅱ型肺泡上皮细胞是氧化损伤的主要靶点，其特点是较难分离获取且难以在体外传代［8］。而人肺泡上皮细胞与Ⅱ型肺泡上皮细胞的形态及生化特性相似，因而本实验选择人肺泡上皮细胞作为研究对象，探讨二甲双胍对急性肺损伤细胞凋亡、迁移和EMT的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验时间 本实验时间为2022年6—11月。

1.2 主要材料、试剂及仪器 人肺泡上皮细胞（A549细胞）购自中国科学院细胞库。二甲双胍、过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）（上海碧云天生物技术有限公司，纯度≥98%），p38 MAPK信号通路抑制剂——SB203580、p38 MAPK信号通路激活剂——C16-PAF（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥99%），胎牛血清（美国Gibco公司），F-12K培养基（含10%胎牛血清、1%青-链霉素）、RIPA裂解液、CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司），Hoechst 33258染色液（上海爱必信生物科技有限公司），鼠抗人抗体〔E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK、β-actin一抗〕、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（二抗）（英国Abcam公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。MCO18AIC型CO2培养箱（日本三洋电机公司），MF52-N型倒置荧光显微镜（广州市明美光电技术有限公司），IMARK型酶标仪（美国BIORAD公司），FluorChem HD2型凝胶成像系统（美国Proteinsimple公司）。

1.3 细胞培养 取液氮中冻存的A549细胞进行复苏，将其置于F-12K培养基中，在37 ℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁达80%以上时进行细胞传代，取第3代对数生长期细胞进行后续实验。

1.4 分组及给药 将A549细胞分为对照组、H2O2组、2.5 mmol/L二甲双胍组、5.0 mmol/L二甲双胍组、10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组，对照组不做任何干预；H2O2组加入400 μmol/L H2O2作用24 h，以构建体外急性肺损伤细胞模型；2.5 mmol/L二甲双胍组、5.0 mmol/L二甲双胍组、10.0 mmol/L二甲双胍组在H2O2组基础上分别加入2.5、5.0、10.0 mmol/L二甲双胍进行干预；SB203580组在H2O2组基础上加入10.0 mmol/L SB203580进行干预，选取细胞活力最佳时的药物浓度进行后续实验。

将A549细胞分为对照组、H2O2组、10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组、抑制剂组和激活剂组，对照组、H2O2组、10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组干预方法同前，抑制剂组和激活剂组在10.0 mmol/L二甲双胍组基础上分别加入10 μmol/L SB203580和10 μmol/L C16-PAF。在37 ℃、5% CO2条件下培养，每组设置3个复孔。

1.5 CCK-8法测定细胞活力 取对照组、H2O2组、2.5 mmol/L二甲双胍组、5.0 mmol/L二甲双胍组、10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组A549细胞，调整密度为2×105个/ml，将其接种至96孔板中，每孔加入细胞悬液100 μl。各组干预24 h后，加入10 μl CCK-8溶液孵育2 h，使用酶标仪测定各组OD值（450 nm处），计算细胞活力，细胞活力（%）=（目标组OD值-空白组OD值）/空白组OD值×100%。实验独立重复3次。

1.6 Hoechst 33258染色法测定细胞凋亡率 取对照组、H2O2组、10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组、抑制剂组、激活剂组A549细胞，用PBS洗涤2次、5 min/次，加入4%多聚甲醛溶液，于4 ℃环境下固定10 min；用PBS洗涤3次，加入5 mg/L Hoechst 33258染色液染色10 min；用PBS洗涤3次，封固后在倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。细胞凋亡特征为细胞核体积浓缩变小，染色不均，浓染且所发荧光较强，呈亮蓝色。计算细胞凋亡率，细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。实验独立重复3次。

1.7 划痕试验测定细胞迁移率 取对照组、H2O2组、10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组、抑制剂组、激活剂组A549细胞，将细胞接种于6孔板，密度达到90%时，采用200 μl移液器枪头进行划痕试验，在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。采用倒置荧光显微镜拍照记录0 h和24 h划痕情况，计算划痕面积并将其分别记为S0h和S24h，计算细胞迁移率，细胞迁移率=（S0h-S24h）/S0h×100%。实验独立重复3次。

1.8 RT-qPCR法测定EMT相关因子mRNA相对表达量取对照组、H2O2组、10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组、抑制剂组、激活剂组A549细胞，采用RNA抽提试剂盒提取细胞样本总RNA，采用NanoDrop检测RNA的浓度及纯度，并将其反转录合成模板链cDNA，取2 μl反转录产物进行PCR（引物序列：GAPDH上游引物为5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物为5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；E-钙黏蛋白上游引物为5'-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3'，下游引物为5'-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3'；N-钙黏蛋白上游引物为5'-A G A G G A A G A C C A G G A C T A T G A C T T G A G-3'，下游引物为5'-TACTGTGGCTCAGCGTGGATAGG-3'；波形蛋白上游引物为5'-GCGTGACGTACGTCAGCAATATGA-3'，下游引物为5'-GTTCCAGGGACTCATTGGTTCCTT-3'；FN上游引物为5'-TGGAGGAAGCCGAGGTTT-3'，下游引物为5'-CAGCGGTTTGCGATGGTA-3'），以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的mRNA相对表达量。实验独立重复3次。

1.9 Western blot法测定EMT相关因子蛋白及p38 MAPK信号通路相关蛋白相对表达量 取对照组、H2O2组、10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组、抑制剂组、激活剂组A549细胞，提取蛋白并进行定量后上样，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，封闭2 h后参照抗体说明书加入按照一定比例稀释的一抗，4 ℃孵育过夜，次日用TBST洗涤后加入山羊抗鼠IgG二抗，孵育2 h，洗涤3次，最后加入显影液，使用凝胶成像系统拍照记录。蛋白灰度值用G表示，计算蛋白相对表达量，蛋白相对表达量=G目的蛋白/Gβ-actin。实验独立重复3次。

1.10 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活力 干预24 h后，对照组细胞活力为（0.967±0.098），H2O2组为（0.423±0.063），2.5 mmol/L二甲双胍组为（0.500±0.062），5.0 mmol/L二甲双胍组为（0.746±0.086），10.0 mmol/L二甲双胍组为（0.826±0.097），SB203580组为（0.856±0.090）。六组细胞活力比较，差异有统计学意义（F=19.386，P＜0.001）；其中H2O2组细胞活力低于对照组，5.0 mmol/L二甲双胍组、10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组细胞活力高于H2O2组，10.0 mmol/L二甲双胍组细胞活力高于5.0 mmol/L二甲双胍组，差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究选取细胞活力最佳时的药物浓度（10.0 mmol/L二甲双胍）进行后续实验。

2.2 细胞凋亡率、细胞迁移率 六组细胞凋亡率、细胞迁移率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中H2O2组细胞凋亡率、细胞迁移率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组细胞凋亡率、细胞迁移率低于H2O2组，差异有统计学意义（P＜0.05）；抑制剂组细胞凋亡率、细胞迁移率低于10.0 mmol/L二甲双胍组和SB203580组，差异有统计学意义（P＜0.05）；激活剂组细胞凋亡率、细胞迁移率高于10.0 mmol/L二甲双胍组和SB203580组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1～2。

图1 六组细胞凋亡情况（Hoechst 33258染色，×20）Figure 1 Cell apoptosis in six groups

图2 六组细胞迁移情况Figure 2 Cell migration of the six groups

表1 六组细胞凋亡率、细胞迁移率比较（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of apoptosis rate and cell migration rate among the six groups

表1 六组细胞凋亡率、细胞迁移率比较（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of apoptosis rate and cell migration rate among the six groups

注：H2O2=过氧化氢；a表示与对照组比较，P ＜0.05；b表示与H2O2组比较，P＜0.05；c表示与10.0 mmol/L二甲双胍组比较，P＜0.05；d表示与SB203580组比较，P＜0.05

组别 细胞凋亡率 细胞迁移率对照组 5.00±1.00 5.06±0.52 H2O2组 60.00±6.35a 50.36±6.54a 10.0 mmol/L二甲双胍组 33.67±3.42b 20.83±2.78b SB203580组 33.33±3.51b 20.14±2.23b抑制剂组 9.00±1.73cd 3.22±0.33cd激活剂组 54.33±6.21cd 34.51±4.39cd F值 85.654 76.906 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 EMT相关因子mRNA和蛋白相对表达量 六组E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中H2O2组E-钙黏蛋白mRNA和蛋白相对表达量低于对照组，N-钙黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组E-钙黏蛋白mRNA和蛋白相对表达量高于H2O2组，N-钙黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相对表达量低于H2O2组，差异有统计学意义（P＜0.05）；抑制剂组E-钙黏蛋白mRNA和蛋白相对表达量高于10.0 mmol/L二甲双胍组和SB203580组，N-钙黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相对表达量低于10.0 mmol/L二甲双胍组和SB203580组，差异有统计学意义（P＜0.05）；激活剂组E-钙黏蛋白mRNA和蛋白相对表达量低于10.0 mmol/L二甲双胍组和SB203580组，N-钙黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相对表达量高于10.0 mmol/L二甲双胍组和SB203580组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图3。

图3 六组EMT相关因子蛋白表达SDS-PAGE图Figure 3 SDS-PAGE of protein expression of EMT-related factors in the six groups

表2 六组EMT相关因子mRNA和蛋白相对表达量比较（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA and protein relative expression of EMT-related factors among the six groups

表2 六组EMT相关因子mRNA和蛋白相对表达量比较（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA and protein relative expression of EMT-related factors among the six groups

注：FN=纤维连接蛋白；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与H2O2组比较，P＜0.05；c表示与10.0 mmol/L二甲双胍组比较，P＜0.05；d表示与SB203580组比较，P＜0.05

组别E-钙黏蛋白 N-钙黏蛋白 波形蛋白 FN mRNA相对表达量 蛋白相对表达量 mRNA相对表达量 蛋白相对表达量 mRNA相对表达量 蛋白相对表达量 mRNA相对表达量 蛋白相对表达量对照组 1.01±0.10 0.85±0.09 0.43±0.05 0.39±0.04 0.64±0.07 0.65±0.07 0.57±0.06 0.59±0.06 H2O2组 0.58±0.06a 0.50±0.07a 0.66±0.07a 0.51±0.06a 0.89±0.09a 0.87±0.07a 0.95±0.10a 0.89±0.09a 10.0 mmol/L二甲双胍组 0.71±0.08b 0.69±0.07b 0.49±0.06b 0.37±0.03b 0.76±0.08b 0.79±0.08b 0.76±0.08b 0.26±0.03b SB203580组 0.71±0.08b 0.63±0.07b 0.49±0.04b 0.23±0.03b 0.75±0.09b 0.73±0.08b 0.76±0.09b 0.26±0.02b抑制剂组 0.91±0.07cd 1.04±0.11cd 0.26±0.02cd 0.20±0.02cd 0.61±0.07cd 0.56±0.06cd 0.56±0.06cd 0.11±0.01cd激活剂组 0.39±0.04cd 0.30±0.04cd 0.60±0.07cd 0.51±0.06cd 0.88±0.09cd 0.89±0.09cd 0.94±0.08cd 0.77±0.08cd F值 27.233 33.247 19.606 28.827 6.058 8.615 13.657 91.938 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.005 0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 p38 MAPK信号通路相关蛋白相对表达量 六组p38 MAPK相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。六组磷酸化p38 MAPK相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中H2O2组磷酸化p38 MAPK相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组磷酸化p38 MAPK相对表达量低于H2O2组，差异有统计学意义（P＜0.05）；抑制剂组磷酸化p38 MAPK相对表达量低于10.0 mmol/L二甲双胍组和SB203580组，差异有统计学意义（P＜0.05）；激活剂组磷酸化p38 MAPK相对表达量高于10.0 mmol/L二甲双胍组和SB203580组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、图4。

图4 六组p38 MAPK信号通路相关蛋白表达SDS-PAGE图Figure 4 SDS-PAGE of protein expression of p38 MAPK signaling pathway-related in the six groups

表3 六组p38 MAPK信号通路相关蛋白相对表达量比较（±s，n=3）Table 3 Comparison of protein relative expression of p38 MAPK signaling pathway-related among the six groups

表3 六组p38 MAPK信号通路相关蛋白相对表达量比较（±s，n=3）Table 3 Comparison of protein relative expression of p38 MAPK signaling pathway-related among the six groups

注：p38 MAPK=p38丝裂原活化蛋白激酶；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与H2O2组比较，P＜0.05；c表示与10.0 mmol/L二甲双胍组比较，P＜0.05；d表示与SB203580组比较，P＜0.05

组别 p38 MAPK 磷酸化p38 MAPK对照组 0.37±0.04 0.35±0.04 H2O2组 0.38±0.04 0.64±0.07a 10.0 mmol/L二甲双胍组 0.40±0.05 0.27±0.03b SB203580组 0.40±0.05 0.26±0.03b抑制剂组 0.38±0.04 0.13±0.02cd激活剂组 0.40±0.05 0.49±0.05cd F值 0.259 53.464 P值 0.927 ＜0.001

3 讨论

急性肺损伤的发病机制较为复杂且尚未完全明确，属于临床常见的危重症。急性肺损伤能够造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，促使机体出现急性低氧性呼吸功能不全，对患者生命造成严重威胁［9］。目前临床上仍以机械通气为基础对症治疗急性肺损伤，但患者病死率较高［10］。因此，探究能够有效抑制急性肺损伤发生及发展的药物意义重大。二甲双胍为双胍类口服降糖药，在临床上已经应用多年［11］，近年来研究发现，二甲双胍除了具有降糖作用外，还能发挥抗炎作用以及减少氧化应激损伤［12］。据报道，二甲双胍能够对内毒素诱导的急性肺损伤发挥抗炎作用［13］。盛琦等［14］研究显示，二甲双胍对H2O2诱导的细胞损伤具有保护作用。另有研究表明，二甲双胍能够减轻脂多糖诱导的急性肺损伤［15］，但二甲双胍对H2O2诱导的急性肺损伤的作用未见报道。本研究结果显示，H2O2组细胞活力低于对照组，提示H2O2可以诱导A549细胞氧化损伤，降低细胞活力。加入二甲双胍处理后，5.0 mmol/L二甲双胍组、10.0 mmol/L二甲双胍组和SB203580组细胞活力高于H2O2组，说明5.0、10.0 mmol/L二甲双胍和SB203580可以减轻H2O2诱导的氧化损伤，提高细胞活力。本研究选取干预细胞活力的最佳药物浓度（10.0 mmol/L二甲双胍）进行后续实验，结果显示，H2O2组细胞凋亡率、细胞迁移率高于对照组，说明H2O2可促进人肺泡上皮细胞凋亡和细胞迁移；加入10.0 mmol/L二甲双胍和SB203580后，细胞凋亡率、细胞迁移率降低，说明10.0 mmol/L二甲双胍和SB203580均可以抑制H2O2诱导的细胞凋亡和细胞迁移，这与熊存全等［16］研究报道相符。EMT典型特征是在一系列生物学过程中获得具有迁移性与侵袭性间充质表型，其进程与细胞侵袭、迁移能力关系密切，E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白是EMT进程中极为重要的调控因子［17-18］。本研究结果显示，与对照组比较，H2O2组E-钙黏蛋白mRNA和蛋白相对表达量降低，N-钙黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相对表达量升高，10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组E-钙黏蛋白mRNA和蛋白相对表达量高于H2O2组，N-钙黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相对表达量低于H2O2组，提示10.0 mmol/L二甲双胍和SB203580可抑制H2O2诱导的急性肺损伤EMT。

p38 MAPK信号通路在炎症和应激反应中发挥着重要作用，其可诱导炎症及细胞凋亡［19］。近年来研究表明，p38 MAPK信号通路与急性肺损伤关系密切［20］。陈昱晓等［21］研究显示，急性肺损伤小鼠体内存在p38 MAPK信号通路相关蛋白过度激活情况，而阻断该信号通路则能够减轻肺损伤。王贵佐等［22］研究显示，二甲双胍可对脂多糖诱导的急性肺损伤发挥保护作用。武丽涛等［23］研究表明，二甲双胍可能通过抑制p38 MAPK信号通路来发挥抗炎作用。另有研究表明，黄芩苷能够通过抑制p38 MAPK信号通路而有效减轻脂多糖所致的急性肺损伤［24］。既往关于二甲双胍对脂多糖诱导的急性肺损伤影响的研究较多，但关于二甲双胍在H2O2诱导A549细胞发生急性肺损伤过程中对p38 MAPK信号通路的调控作用未见报道，本研究结果显示，H2O2组磷酸化p38 MAPK相对表达量高于对照组，10.0 mmol/L二甲双胍组、SB203580组磷酸化p38 MAPK相对表达量低于H2O2组，提示二甲双胍和SB203580可能抑制了p38 MAPK信号通路的激活。本研究在10.0 mmol/L二甲双胍组基础上分别加入SB203580和C16-PAF发现，与10.0 mmol/L二甲双胍组比较，抑制剂组细胞凋亡率、细胞迁移率、N-钙黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相对表达量、磷酸化p38 MAPK相对表达量降低，E-钙黏蛋白mRNA和蛋白相对表达量升高，激活剂组则与抑制剂组结果相反，提示二甲双胍可能通过抑制p38 MAPK信号通路激活而抑制H2O2诱导的细胞凋亡、迁移及EMT。

综上所述，二甲双胍可能通过抑制p38 MAPK信号通路激活而抑制H2O2诱导的急性肺损伤人肺泡上皮细胞凋亡、迁移及EMT。下一步需在动物模型中探究二甲双胍对H2O2诱导的急性肺损伤的作用机制，为阻断急性肺损伤的相关研究提供更为全面的理论参考。

作者贡献：欧阳运萍进行文章的构思与设计，论文的修订；陈涛进行研究的实施与可行性分析；李鹏进行资料收集；欧阳运萍、陈涛负责论文撰写；赵博进行统计学处理；杨小军进行资料整理，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。