金胺“O”荧光染色法与萋—尼染色法在肺结核细菌学检验中的准确性

王亚茹 吕思遥 郑牛威 史雯舒

1 天津市河东区疾病预防控制中心 300171;2 天津市红桥区疾病预防控制中心; 3 天津市水阁医院; 4 天津市河西区中医院

肺结核是全球常见的慢性呼吸系统传染性疾病,主要是因结核分枝杆菌感染引起。结核分枝杆菌早期、快速、准确鉴定,是肺结核治疗及管理的重要环节[1]。细菌分离培养法能够进行菌种鉴定及药敏试验,但操作复杂、烦琐,培养周期长,难以及时予以结果报告[2]。随着实验室诊断技术的发展,Xpert MTB/RIF检测逐渐用于临床,其操作准确、快速、安全性高,可满足临床检验需求[3],但其检验价格昂贵,患者难以接受。因此抗酸染色法仍在结核分枝杆菌感染的检测中占据着重要作用,其中萋—尼染色法是重要手段,随着荧光染色技术的发展,金胺“O”荧光染色法在临床上的应用取得一定效果[4]。故本文比较金胺“O”荧光染色法与萋—尼染色法对结核分枝杆菌的检验准确性,旨为抗酸染色法的选择提供参考,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取在2018年1月—2022年10月期间预进行肺结核病筛查的痰标本360份,痰液标本均对应有详细的病例资料,其中男192例,女168例;年龄30～76(58.31±3.15)岁。纳入标准:(1)选取的痰液标本病例均有持续咳嗽、咳痰,伴咯血或有血痰症状;(2)发热、胸痛持续时间超过2周;(3)选取痰液标本合格,为血性、脓性、干酪样或黏液性痰,痰量超过2ml;(4)均有完整的临床资料。排除标准:(1)痰液标本不合格或被污染;(2)伴恶性肿瘤、急慢性感染者;(3)临床资料不全者。

1.2 检测方法 选取病例晨起痰液,每份痰液制作4张痰涂片,2张为直接痰涂片,2张为次氯酸钠液化离心沉淀集菌痰涂片。由珠海贝索生物技术有限公司生产的金胺“O”荧光染色液与萋—尼染色液,日本尼康E200型光学显微镜,正值相差荧光显微镜,100倍油镜下观察。

选取痰液内的脓样、干酪样及血性物质,剂量在0.05～0.1ml。将挑选的标本均匀涂抹在玻片正面右侧2/3部位,使痰膜朝上,厚度适中,形成卵圆形痰膜,10mm×20mm。

萋—尼染色法:在痰标本涂抹于痰膜片后,自然干燥,置于染色架上,先添加石炭酸复红溶液,覆盖全部玻片,玻片距离10mm以上进行加热固定,于5s内对玻片进行火焰加热,待出现蒸汽后脱离火焰,维持染色5min。流水冲洗后再次添加酸性乙醇美蓝溶液,覆盖全部玻片,脱色1min;若有块状红色残留,再次对脱色液进行流水冲洗,至痰膜片无红色;再添加亚甲蓝复染液,覆盖全部玻片,染色时间为30s,用流水将其冲去,沥干水,待其自然干燥后进行镜检。连续观察300个视野,阴性:未出现抗酸杆菌;阳性(+):每100个视野出现1～9条抗酸杆菌;(++):每10个视野出现1～9条抗酸杆菌;(+++):每1个视野出现1～9条抗酸杆菌;(++++):每1个视野出现至少10条抗酸杆菌;至少观察20个视野。

金胺“O”荧光法:将处理后的玻片置于染色架上,滴加0.1%金胺“O”染色液,全部覆盖玻片,放置时间为15min;流水缓慢冲洗,将初染液全部冲去后,添加0.5%盐酸乙醇进行脱色,持续时间为2min,至外观无黄色;随后再次复染,脱色液用流水缓慢冲洗,滴加0.5%高锰酸钾复染液,全部覆盖玻片,持续时间为1min;再用流水冲洗复染液,沥干水分,自然干燥后准备镜检。阴性:未出现抗酸杆菌;阳性:(+):每50个视野出现10～49条抗酸杆菌;(++):每1个视野出现1～9条抗酸杆菌;(+++):每1个视野出现10～99条抗酸杆菌;(++++):每1个视野出现至少100条抗酸杆菌;至少观察20个视野。由两名经验丰富、专业性强、工作时间超过5年的检验人员观察及详细记录数据。

1.3 观察指标 (1)比较金胺“O”荧光染色法与萋—尼染色法的检测价值,以酸性罗氏(L-J)培养基上做痰培养法(L-J痰培养)为金标准,计算两种染色方法的阳性检出率,计算其诊断价值:敏感度、特异度、准确性、阳性预测值及阴性预测值;(2)比较两种染色技术对(+)(++)(+++)(++++)抗酸杆菌阳性检出率;(3)比较两种染色法的平均检验耗费时间。

2 结果

2.1 两种染色法检测结果及诊断价值比较 360例疑似肺结核患者L-J痰培养法检测,共检测出阳性124例(34.44%),金胺“O”荧光染色法检测出阳性120例(96.77%),萋—尼染色法检测出阳性108例(87.10%),见表1;金胺“O”荧光染色法检测肺结核的敏感度、特异度、准确性、阳性预测值及阴性预测值均高于萋—尼染色法,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表1 两种染色法对肺结核检测分布情况比较(n)

表2 两种染色法对肺结核诊断价值比较(%)

2.2 两种染色方法对抗酸杆菌阳性检出率比较 金胺“O”荧光染色法对抗酸杆菌阳性检出率高于萋—尼染色法,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 两种染色方法对抗酸杆菌阳性检出率比较[n(%)]

2.3 两种染色法检验耗费时间比较 金胺“O”荧光染色法检验耗费时间为(32.14±5.36)min,萋—尼染色法检验耗费时间为(47.15±5.48)min,二者差异有统计学意义(t=37.153,P=0.000)。

3 讨论

肺结核是我国高发病率的传染性疾病,控制结核病的传播首要环节是早期诊断与及时治疗。通常临床诊断肺结核时,多依据结核病细菌学检查结果。结核分枝杆菌液体培养法诊断敏感度高,可进行菌种鉴定及药敏试验,但其操作相对复杂、烦琐,细菌培养时间长,平均阳性报告时间需要13d,阴性报告时间需要42d[5]。实时荧光检测(PCR)法能够在短期内完成细菌培养及检测,但对于基层医院而言,各医院实验室普遍没有条件开展,且因实验室技术人员能力及专业水平参差不齐,更进一步限制其应用[6]。因此痰涂片镜检仍是实验室检测结核分枝杆菌的主要方法。

结核分枝杆菌细长且略微弯曲,细胞壁脂质含量高,大量分枝菌酸包裹在肽聚糖层的外层,从而会影响染色过程。其中萋—尼染色法是镜检的常规染色技术,以5%石炭酸复红加温染色,3%盐酸乙醇避免脱色,再用亚甲蓝复染,此时结核分枝杆菌最后呈红色,而其他细菌以及背景呈蓝色[7]。金胺“O”荧光染色法的检测原理与萋—尼染色法的检测原理基本相同,均添加一定量的石炭酸,作为媒染剂,以此充分显示结核分枝杆菌[8]。本文结果显示,金胺“O”荧光染色法检测肺结核的敏感度、特异度、准确性、阳性预测值及阴性预测值均高于萋—尼染色法,对抗酸杆菌阳性检出率高于萋—尼染色法,差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明与萋—尼染色法相比,采用金胺“O”荧光染色法可提高结核分枝杆菌的检出率,诊断价值高。分析原因是萋—尼染色法检测时,当细菌浓度达到10 000个/ml时,才能被检测出,难以发现少量细菌,故而阳性检出率较低;金胺“O”荧光染色法只需要适当加热处理,促使荧光染料能顺利渗透结核分枝杆菌内,在暗背景下,细菌呈现黄绿色荧光,故而能增加细菌检出率[9]。

本文结果显示,金胺“O”荧光染色法检验耗费时间短于萋—尼染色法,差异有统计学意义(P<0.05)。说明金胺“O”荧光染色法检测过程较萋—尼染色法简便,操作时间短,能相应减轻操作人员的工作负担。分析原因是萋—尼染色法操作较为烦琐,在染色加热时容易产生气溶胶,对检验人员身体健康造成一定危害;同时该染色法技术要求高,油镜观察时的视野范围小,镜检时间长,检验人员容易产生疲劳感[10]。金胺“O”荧光染色法过程中添加荧光染色液,可暗色背景下,细菌可呈现明显的黄绿色荧光,此时容易被发现,可减轻检验人员镜检时间及工作负担,增加工作效率,以此能缩短检验时间[11]。

金胺“O”荧光染色法注意事项:(1)荧光染色后涂片需要在24h内完成镜检;必要时可置于4℃环境内进行保存,于第2天完成镜检,以免时间越久,荧光减退导致阳性结果不准确[12];(2)荧光染色液置于棕色瓶内保存,保存时间不宜超过2周,以免影响荧光染色效果;(3)40×背景下难以区别个别抗酸杆菌,此时需要采用100×油镜下进行观察[13];(4)染色时,水流冲洗背面速度宜细弱,避免流水污染荧光素,影响镜检结果[14];(5)每张涂片的镜检视野数量会影响染色法的诊断灵敏度,当镜检视野越多,其检测灵敏度越高,故建议每张涂片观察300个视野以上,以此提高临床诊断价值[15]。

综上所述,与萋—尼染色法相比,金胺“O”荧光染色法可提高肺结核分枝杆菌阳性率,诊断敏感度、特异度、准确度高,检测耗费时间短,操作简单、方便,可提高检验人员的工作效率,适用于大批标本检测,值得临床应用。但要求人员镜检操作经验丰富,掌握染色流程,注意自身防护,从而提高工作安全性及检验质量。