结核杆菌分泌蛋白MPT64多克隆抗体的制备及初步应用*

黄 震 曾 健 孙俊生

(1深圳市龙岗中心医院临床医学院办公室；2深圳市龙岗中心医院麻醉科；3深圳市龙岗中心医院呼吸科 广东深圳 518116)

结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一种可通过呼吸道传播的古老传染病，耐药结核病上升和免疫低下人群增加等因素却给结核病防治带来了沉重压力[1]。面对严峻的结核病防治形势，当前各种结核病诊治方法已逐渐不能满足临床的需求，寻找新的诊断标志物和研发新的实验诊断方法已成为结核病研究亟待解决的难题。MPT64也被称为MPB64[2]，由MTB基因组中的mpt64基因(即Rv1980c)编码。该蛋白是MTB生长过程中向周围环境分泌的一种蛋白质，由228个氨基酸组成，大小约为24kD。MPT64存在于活跃复制的细菌细胞中，在培养初期大量分泌，随着培养时间的延长而减少[3]。 MPT64不存在于弱毒性的BCG菌株中，提示其可能 是AM毒力相关因子。MPT64参与机体与免疫系统的相互作用[4-5 ]，可诱导抗原特异性T细胞免疫反 应，有可能作为诊断活动性结核的标志物[6 ]。

文章通过 结核分枝杆菌MPT64蛋白在大肠杆菌中的表达，纯化重组的MPT64蛋白抗原，研究其免疫学特性，用ELISA法和免疫组化分别检测抗体的效价和特异性，通过对结核淋巴结组织切片进行免疫组织化学分析验证，探讨MPT64在结核不同分期的表达情况，同时检测了45例结核患者血清MPT64的表达，进一步分析MPT64的表达与结核不同分期的相关性，探讨检测MPT64在结核诊断方面的初步应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料

Balb/C小鼠由广东医学院实验动物中心提供。限制性内切酶、T4连接酶及TaqDNA聚合酶等分子生物学试剂为QiaGen公司产品。表达载体pET28a和Ni2+-NTA凝胶为Invitrogen公司产品。大肠杆菌DH5ɑ及BL 21(DE3)为本实验室保存。HRP标记的羊抗鼠IgG、Cy3标记的羊抗鼠IgG以及FITC标记的抗人CD19抗体为Biolegen公司产品。常规试剂为分析纯。引物合成及DNA序列测定委托上海Invitrogen生物工程公司完成。收取深圳市龙岗中心医院2020年4月-2022年2月手术切除的结核淋巴结组织45例，项目开展通过深圳市龙岗中心医院伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1 MPT64基因的克隆 从手术切除的淋巴结组织中抽提RNA，用RT-PCR扩增MPT64编码区基因。引物的序列如下：P1：5’-CGGGATCCTCCAACGTCCCCCA -3’(划线部分为BamH I 酶切位点)；P2：5’-GGAATTCCTCAGAAGATCCTCAC-3’(划线部分为EcoR I 酶切位点)。PCR产物经2%浓度的琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化，用BamH I和EcoR I分别对PCR产物和表达载体pET28a进行双酶切，回收酶切产物，将连接产物转化入感受态大肠杆菌DH5ɑ。挑取白色菌落进行培养，提取重组质粒，以BamH I、EcoR I 进行双酶切鉴定，将质粒命名为pET28a/ MPT64

1.2.2 重组MPT64的表达与纯化 以重组质粒pET28a/ MPT64转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，待菌液的OD600值达1.0时，加入IPTG (终浓度为0.8 mmol/L)，于37℃诱导表达4 h。离心收集菌体，使用高压均质仪碎菌，经过12000g离心10min，收集上清，用Ni2+-NTA凝胶柱进行亲和层析纯化，以含200 mmol/L咪唑的缓冲液进行洗脱纯化，行SDS-PAGE分析。

1.2.3 抗MPT64抗体的制备、纯化及鉴定 将纯化的MPT64使用3kD超滤管离心除去咪唑、0.22μm滤器过滤除菌后，经过Bradford法测定并调整蛋白的浓度为1 g/L，与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫Balb/C小鼠。待末次免疫完毕后1周，使用毛细管内眦取血并分离血清。以纯化的重组MPT64 (5mg/L)包被ELISA板，用直接ELISA法检测抗血清的效价。用Western blot鉴定抗体的特异性，即分别取未经IPTG诱导和经IPTG诱导的工程菌裂解物以及纯化的重组蛋白(MPT64)进行SDS-PAGE，以制备的抗血清(1：5 000)为一抗，兔抗鼠IgG-HRP(1∶5000)为二抗进行反应，用化学发光显色。

1.2.4 淋巴结组织表达MPT64 取45例将新鲜的组织按照病理切片的常规操作进行，同一份组织切片使用H-E染色后进行病理分期，一份使用制备的抗MPT64多克隆抗体(1：5000稀释)作一抗，使用兔抗鼠IgG-HRP(1：5000)为二抗进行反应，DAS显色后进行评分。每组都包括适当的阳性及阴性对照，认为胞浆染色是阳性。

1.3 统计分析

所有数据均采用SPSS 23.0统计学软件包分析。由于蛋白表达的不常规分布，用非参数型检验来进行统计学评价。应用卡方检验来评估三组组织中MPT64表达水平的不同，设置p<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 MPT64编码区基因的扩增及MPT64表达载体的构建、鉴定

PCR扩增产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，在约600bp与800bp之间可见一条特异带，与预期的扩增的目的基因片段的620bp大小相符。提取质粒，经PCR和BamH I、EcoR I 双酶切鉴定后，扩增产物和酶切下来的片段同预期的片段的大小相符，经进一步测序鉴定，大小约为620bp。BLAST分析显示，得到TSPA33编码区基因，碱基无突变，阅读框正确。将其片段酶切后连至质粒pET28a，构建得重组质粒pET28a/MPT64，转化提取质粒，经PCR和BamH I、EcoR I 双酶切鉴定后，测序结果显示无碱基突变，阅读框正确 (详见图 1)。

图1 PCR获得的MPT64基因行琼脂糖凝胶电泳分析注：1：MPT64基因的RT-PCR产物；2：无模板对照；M：marker

2.2 重组 MPT64的表达、纯化与鉴定

以表达质粒pET28a/ MPT64转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到含重组质粒的基因工程菌。行12% 浓度SDS-PAGE分析结果显示，经IPTG诱导的工程菌在Mr约20～30kD之间有1条外源性高表达的蛋白条带。该融合蛋白的Mr同预测的大小相吻合；而未经IPTG诱导的工程菌未见有外源蛋白表达的条带，以pET28a载体转化的菌株在IPTG诱导后也未见有外源性蛋白表达的条带，表明 MPT64在大肠杆菌中得到高效表达。工程菌菌体裂解上清经Ni2+-NTA凝胶柱纯化获取了重组 MPT64 (见图2A)。经诱导表达、纯化获得的重组MPT64蛋白，扫描分析其纯度约为95%(见图2B)。

图 2 MPT64诱导表达后的SDS-PAGE鉴定及WB鉴定A：M：蛋白marker；1：无IPTG诱导的BL21(pET28a/ MPT64)；2：IPTG诱导的BL21(pET28a)；3，4，5：IPTG分别诱导1、2、3小时的BL21(pET28a/ MPT64)；3.IPTG诱导的BL21(pET28a)；B：纯化后的MPT64蛋白

2.3 鼠抗人MPT64抗体效价测定

以纯化的重组MPT64 (5 mg/L)包被ELISA板，以未经MPT64免疫的Balb/C小鼠血清作为阴性对照，抗MPT64血清和未免疫血清按照1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000稀释，以相同稀释倍数的免疫血清测得OD450nm/未免疫血清测得的OD450nm最大值的稀释度为其效价。发现在1∶32000时，其ODimmu/ODunimmu为6.78，即鼠抗人MPT64血清效价为1∶32000 (见图3A)；经纯化的WB鉴定，发现制备的抗体能够与纯化的MPT64特异性结合(见图3B)。

图3 鼠抗MPT64血清效价的测定及特异性验证(A)*：在血清稀释度同为1∶64000时，免疫小鼠血清测得的OD值/未免疫小鼠血清测得的OD值最大；(B)1：pET28a/ MPT64诱导、纯化的MPT64经免疫血清行WB鉴定

2.4 鼠抗人MPT64抗体在膀胱癌免疫组化中的应用

以制备的兔抗人MPT64作为一抗，进行免疫组化检测。结果显示，结核淋巴结组织其MPT64 表达远高于周围正常组织 (见图4A和4B)，表明所制备的抗体可与人MPT64特异性结合。而后根据不同分期与免疫组化对细胞膜表面MPT64的表达指数进行相关性分析，可知浸润期或进展期，溶解播散期，吸收好转期，硬结钙化期与MPT64表达呈负相关，即随着结结核病情治疗好转MPT64表达越低，且差异具有统计学意义(见表1)。

图4 制备抗人MPT64在淋巴结免疫组化中的应用注：(A)结核淋巴结组织MPT64 表达高；(B)正常淋巴结组织MPT64低表达。

表1 MPT64蛋白表达与临床病理因素之间的相关性

3 讨论

目前结核病实验室诊断的方法较多，如传统的抗酸染色和分枝杆菌培养，较后出现的荧光定量PCR和噬菌体检测法，还有抗原抗体检测和干扰素释放检测等免疫学检测方法，这些方法既有各自的优点，但也存在某些不足，如检测时间长、操作繁琐或准确性较低等。MPT64是MTB生长过程中分泌最多的蛋白之一，有研究者应用质谱技术对肺结核患者血清外泌体中的蛋白质肽类进行了分析，发现外泌体中包含20种能用于MTB检测的蛋白质，其中就包括MPT64、Ag85B等MTB分泌蛋白[7]。Liu Z等应用自建的ELISA方法检测肺结核患者血液中MPT64，其阳性率可达71.2%，明显高于CFP10、ESAT6等其它分泌蛋白[8]。因此，MPT64作为MTB的一种抗原可用于结核病的实验室诊断。

该研究用RT-PCR技术从手术切除的结核淋巴结中获取了人MPT64编码基因，并用pET28质粒构建了其原核表达载体，以纯化的重组蛋白为免疫原免疫Balb/C小鼠，制备了效价高、特异性好的多克隆抗体，免疫组织化学染色检测显示该抗体能识别天然的人MPT64分子，具有良好的活性。该研究进一步探讨了MPT64蛋白在结核淋巴结组织中的表达。通过结核病浸润期或进展期，溶解播散期，吸收好转期，硬结钙化期不同分期MPT64的表达情况分析。结果显示，MPT64在结核淋巴结中中表达高于正常淋巴结组织，而后根据不同分期与免疫组化对细胞膜表面MPT64的表达指数进行相关性分析，结核病情治疗好转MPT64表达越低，提示MPT64蛋白表达与临床病理因素之间有较好的相关性，对45例结核患者的血清进行MPT64检测，检测阳性率高达77.8%。

研究者尝试通过直接检测痰液、淋巴结穿刺液[9]和胸腔积液[10]等标本中的MPT64来实现结核病的直接诊断。经研究发现，通过结核病浸润期或进展期，溶解播散期，吸收好转期，硬结钙化期不同分期MPT64的表达情况分析，提示MPT64蛋白表达与临床病理因素之间有较好的相关性。同时，进一步比较MPT64在结核初治组与复治组MPT64的表达情况，最后与经典的结核诊断ELISpot方法比较，发现MPT64是MTB分泌的一种特异性蛋白质，其作为结核病生物标志物的价值在肺外结核病诊断中也得到了初步验证，加之该蛋白在结核病患者血液中的含量明显高于其它分泌蛋白，其作为结核病血清诊断标志物的价值已逐渐受到重视并得到初步发掘[11]。

综上所述，血清及淋巴结组织标本显示MPT64检测在结核病诊断中都具有较好的临床性能，由于MPT64蛋白可被大多数结核患者和结核感染者的免疫系统所识别，既能诱导体液免疫反应，又能刺激细胞免疫反应，是用于结核分枝杆菌诊断的良好指标，可作为TB血清学及痰液诊断的备选抗原之一[12]。如将MPT64与其他特异性抗原联合使用进行血清学诊断，有望进一步提高TB早期诊断的灵敏度。