混菌发酵对雪茄烟叶化学成分及香气品质的影响

毛亚浩，张彤彤，余君，李道宇，陈雄，杨春雷，姚兰

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，武汉 430068；2.湖北省烟草科学研究院，武汉 430030）

雪茄烟叶经采收晾制后无法直接用于雪茄的生产，必须经过发酵才能达到工业加工的需求，未经发酵的烟叶青杂气重且刺激性较大，这是因为在雪茄烟叶内存在多种大分子物质，这些物质含量在燃烧过程中会产生大量难闻气体，影响雪茄烟叶整体品质［1］。发酵是改善雪茄烟叶品质的重要环节，一般分为自然发酵和人工发酵，与自然发酵相比，人工发酵具有成本低、周期短的优点，雪茄烟叶发酵中常采用人工发酵的方法［2-4］。研究发现，在发酵过程中人工添加部分微生物可以减少烟叶内大分子物质含量，进而提高雪茄烟叶吸食品质，使烟叶口感更加协调［5］。

酵母菌是一类可以产生香气物质的真菌，由于其产生香味物质种类繁多，常被用于食品行业［6-8］，Assi-clair等［9］研究结果表明，酿酒酵母发酵可可豆可以促进酯、醛、酮和吡嗪等香味物质的形成，使其具有强烈的果香和花香。近年来，部分研究结果表明混菌发酵相比于单菌发酵更有利于产品风味的形成［10］，Singracha等［11］使用嗜盐四联球菌、鲁氏接合酵母和季也蒙毕赤酵母混合发酵制备酱油，结果表明，与对照相比，乙醇、2-甲基-1-丙醇和麦芽酚等挥发性风味化合物含量显著提高；Xu等［12］研究发现，使用混合发酵剂（季也蒙毕赤酵母、毕赤酵母和旧金山乳杆菌）发酵面包可以增强其感官品质，促进2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、糠醛和乙酸等芳香化合物的形成。Hou等［13］研究表明，接种葡萄园有孢汉逊酵母P5 和酿酒酵母P1 发酵后的苹果酒中2-苯基乙酸乙酯（玫瑰和蜂蜜香味）是对照的4.6倍，经感官分析发现混合发酵后的苹果酒香味明显改善。

酵母菌具有较强的产香能力，但将酵母菌应用于雪茄烟叶发酵中以提高雪茄烟叶香气的报道较少。本研究以从雪茄烟叶表面筛选出来的一株纤维素降解菌C1 与5 种具有产香能力的酵母共同处理雪茄烟叶，探究复合微生物对雪茄烟叶挥发性香气物质含量以及品质的影响，同时也能为酵母菌在雪茄烟叶发酵中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟叶来源于湖北省十堰市丹江口市习家店烟草站CX-014 晾制结束的雪茄茄芯中部烟叶。

供试菌株C1 筛选自雪茄烟叶表面；库德毕赤酵母、费比恩酵母、汉逊酵母、Starmerella bacillaris、拜尔接合酵母均使用由本实验室保藏的菌株。

纤维素产酶培养基：蛋白栋10 g，酵母粉10 g，CMC-Na 10 g，NaCl 5 g，KH2P041 g，去离子水1 000 mL，pH 5.8～6.0，121 ℃高压灭菌20 min。

YPD 培养基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，去离子水1 000 mL，115 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 发酵方法 参考覃明娟等［14］的方法并修改，供试烟叶回潮至适当水分后切成烟丝，将培养至对数生长后期的菌株C1 与4.5‰葡萄糖、2.25‰谷氨酸混合后，加入无菌水充分溶解制成接种液，将接种液均匀喷洒在烟丝上，平衡水分后，保持烟叶水分为30%，然后放入37 ℃恒温恒湿培养箱中进行发酵，发酵6 d 后接种酵母菌，30 ℃继续发酵6 d，其中菌株C1 的单菌发酵条件为单独接入菌株C1 和上述浓度的葡萄糖、谷氨酸37℃发酵6 d，酵母菌单菌发酵条件为单独接种酵母菌30 ℃发酵6 d，发酵结束后，40 ℃烘干制样。

1.2.2 发酵方案 由于在试验过程中发现菌株C1与酵母菌同时发酵雪茄烟叶过程中无法共同生长，因此采用分段发酵的方法进行雪茄烟叶的发酵，试验方案设计见表1。

表1 试验方案设计

1.2.3 烟叶主要化学成分测定 参照Yao等［15］的方法进行测定，取烘干后的烟叶粉末0.25 g，加入25 mL萃取液（1%乙酸，2%乙醇）震荡1 h后，使用连续流动分析仪对过滤后的上清液进行化学成分测定。

1.2.4 同时蒸馏萃取（SDE）烟草挥发性香气物质 将烟叶去除主脉，烘干粉碎过筛后，准确称取10.0 g，放入1 000 mL 圆底烧瓶中，并加入200 mL 饱和食盐水；称取60 mL 二氯甲烷于100 mL 圆底烧瓶中，分别连接在SDE 装置两侧。有机相（二氯甲烷）使用55 ℃水浴加热，水相使用160 ℃油浴加热。待水相和有机相达到液液分层后，继续反应5 h，收集有机相萃取液，同时使用旋转蒸发仪将萃取液浓缩至2 mL，加入50 μL 1.202 8 mg/mL 乙酸苯乙酯作为内标。干燥后，使用0.22 μm 微孔有机滤膜过滤后装入Agilent进样瓶中。

1.2.5 GC/MS 条件 气相色谱：Agilent Techologies 7890A；色谱柱：HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样量：1 μL；载气：氦气；流速：1 mL/min；分流比：10∶1；进样口温度：250 ℃；升温程序：40 ℃保持2 min，以2 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min，然后10 ℃/min升至280 ℃；质 谱：Agilent Techologies 5975C；传输线温度：250 ℃；离子源温度：230 ℃；电离方式EI：70 eV。

1.3 数据处理

所有试验均设置3 个平行，采用Origin 2019 作图、Excel进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中雪茄烟叶主要化学成分的变化

烟叶主要化学成分是影响雪茄烟品质的重要指标，决定了烟叶吸食的协调性［16］。雪茄烟发酵过程中主要化学成分变化如图1 至图4 所示。由图1 可以看出，在雪茄烟叶发酵过程中，还原糖含量总体呈下降趋势，但还原糖降低速率有较大差异，说明在雪茄烟叶发酵过程中微生物利用还原糖作为碳源进行生长发育。其中在单菌发酵方案中，雪茄烟叶发酵结束后还原糖含量在0.28%～0.32%，而在混合发酵方案中，其还原糖含量在0.21%～0.26%，这可能是由于接种微生物种类不同，其在雪茄烟叶固态发酵过程中的生长情况不同所致。图2 是发酵过程中雪茄烟叶总糖含量的变化趋势，可以看出在发酵过程中总糖含量变化趋势与还原糖基本一致，其中单菌方案中，发酵结束雪茄烟叶总糖含量在0.70%～0.83%，而混合方案总糖含量在0.60%左右。

图1 雪茄烟叶发酵过程中还原糖含量的变化

图2 雪茄烟叶发酵过程中总糖含量的变化

烟碱是雪茄烟中重要的植物碱，烟碱含量决定了烟叶的劲头，也是烟叶中主要有害物质之一［17］。图3 和图4 分别是雪茄烟叶发酵过程中烟碱和总氮含量的变化曲线图，可以看出在雪茄烟叶发酵过程中烟碱和总氮含量基本保持不变，其中烟碱含量为5.24%～5.71%，而总氮含量为2.71%～3.20%，这与张锐新等［18］的研究结果一致。

图3 雪茄烟叶发酵过程中烟碱含量的变化

图4 雪茄烟叶发酵过程中总氮含量的变化

2.2 雪茄烟叶中挥发性中性香气物质的变化

对不同方案发酵过程中雪茄烟叶挥发性中性香气成分进行测定，共发现23 种香气物质，可分为5类：美拉德反应产物、苯丙氨酸转化产物、类胡萝卜素转化产物、西柏烷类转化产物以及其他香气物质［19］。由表2 和表3 可以看出，单菌发酵方案中，菌株C1 和费比恩酵母发酵后的雪茄烟叶总香气含量较高，分别为638.17 μg/g 和606.53 μg/g。混菌发酵后，雪茄烟叶香气物质含量显著提高，其中菌株C1和汉逊酵母共同处理后的雪茄烟叶总香气物质含量最高为998.09 μg/g，与单菌发酵中香气物质含量最高的方案相比提高了56.4%。试验结果表明，雪茄烟叶在经过菌株C1 处理后再经过库德毕赤酵母、汉逊酵母、费比恩酵母和Starmerella bacillaris继续发酵可以有效提高雪茄烟叶挥发性香气物质含量，从而进一步提高雪茄烟叶品质。

新植二烯是雪茄烟叶中含量最高的挥发性香气物质，新植二烯在雪茄烟叶燃烧时可以携带其他香气物质进入烟气，是烟叶的重要增香剂［19］。在单菌发酵方案中，新植二烯含量最高为471.19 μg/g，而在混菌阶段发酵方案中，除拜耳接合酵母外，其余4 种酵母菌与菌株C1 共同发酵后的雪茄烟叶新植二烯含量均明显高于单菌阶段发酵，其中菌株C1 和汉逊酵母共同发酵后的雪茄烟叶中新植二烯含量高达755.38 μg/g。

雪茄烟叶发酵过程中美拉德反应产物主要有糠醛、糠醇等呋喃类物质［20］，由表2、表3 可知，单酵母发酵方案中，拜耳接合酵母处理后的雪茄烟叶美拉德反应产物含量最高为4.17 μg/g，而混菌发酵后的雪茄烟叶美拉德反应产物含量明显提高。其中方案10 即菌株C1和Starmerella bacillaris共同发酵后的雪茄烟叶中美拉德反应产物含量最高为15.39 μg/g，约是未经菌株C1 处理组的4 倍。在菌株C1 分别与库德毕赤酵母和拜耳接合酵母混合发酵的雪茄烟叶中糠醇含量较高分别为7.22 μg/g 和7.78 μg/g，约是单酵母发酵烟叶中的5倍，约是单菌株C1 发酵的1.4倍。单菌发酵方案中，菌株C1 发酵后的烟叶中美拉德反应产物含量最高，除汉逊酵母外，其余酵母菌方案的雪茄烟叶无明显差异；而混菌方案中，除菌株C1 和费比恩酵母处理后烟叶美拉德反应产物较低，其余组合差异较小。这些差异可能与美拉德反应产物的形成有关，美拉德反应产物是由还原糖和氨基酸在一定温度下发生的［21］，而菌株C1 在雪茄烟发酵过程中可以产生纤维素酶，使部分纤维素转化为还原糖更有利于美拉德反应进行。

苯丙氨酸转化产物是雪茄烟重要的香气成分，其中苯乙醇、苯甲醇等具有强烈的花香，可以显著提高雪茄烟的风味［20］。分析发现，经菌株C1、菌株C1与汉逊酵母以及菌株C1与Starmerella bacillaris共同发酵后的雪茄烟叶苯丙氨酸转化产物含量较高，在36.25～43.69 μg/g，是其余方案的2 倍左右。经过复合微生物发酵的烟叶与单菌相比苯甲醇、苯乙醇含量明显提高，这对提高雪茄烟风味有重要作用。值得注意的是在单菌发酵后的雪茄烟叶中都检测到苯乙醛的存在，而在混菌发酵后苯乙醛基本消失，推测可能是由于添加复合微生物导致雪茄烟表面微生物组成发生变化，促进苯乙醛脱氢转化为苯乙醇所致［22］。另外经汉逊酵母和费比恩酵母发酵过的雪茄烟叶苯甲醇含量均明显提高，说明这两种酵母更有利于苯甲醇的合成。

类胡萝卜素转化产物是烟叶中除新植二烯外含量最高的香气物质种类，由表2、表3 可以看出，单酵母菌发酵后的雪茄烟叶类胡萝卜素转化产物含量差异不大，含量在38.40～45.00 μg/g，说明酵母菌对类胡萝卜素转化作用不显著。除库德毕赤酵母外，经过菌株C1 和其余酵母菌发酵后的雪茄烟叶类胡萝卜素转化产物含量均明显提高，其中菌株C1 与汉逊酵母共同发酵后的烟叶中类胡萝卜素转化产物含量最高为80.85 μg/g，约是单酵母发酵的2 倍。与单酵母发酵相比，经过菌株C1 发酵后的烟叶中大马士酮、巨豆三烯酮A 以及巨豆三烯酮B 含量均明显提高。推测可能是由于菌株C1 在发酵过程中可以产生CCD1、CCD4 等类胡萝卜素裂解双加氧酶从而促进类胡萝卜素的降解转化［23］。西柏烷类转化产物主要是茄酮，研究结果发现，各方案中茄酮含量变化不明显，均在20 μg/g 左右。

表2 单菌发酵挥发性中性香气物质含量（单位：μg/g）

表3 混菌发酵挥发性中性香气物质含量（单位：μg/g）

产香酵母在烟叶上的应用报道较少，近年来有部分学者将产香酵母应用到烟叶发酵中，得到了较好的效果。胡志忠等［24］利用产香酵母发酵烟叶后发现烟叶中新增多种致香物质，且新植二烯含量与对照相比增加了78.07 μg/g。郭林青等［25］研究结果表明，汉逊酵母发酵烟沫后其醇类物质含量明显增加，与对照相比其发酵液香味明显改善。帅瑶等［26］、薛磊等［27］研究发现复合微生物对烟叶发酵后，烟叶中β-大马酮等多种香气物质含量增加，烟气细腻度改善，香气质和香气量均有增加，杂气减轻显著，烟叶质量明显改善，这与本研究结果一致。

3 结论

本研究使用阶段发酵的方法处理雪茄烟叶，通过利用菌株C1 对烟叶纤维素的降解作用以及酵母的产香能力对雪茄烟叶进行发酵，结果发现，单酵母发酵方案中费比恩酵母发酵后的雪茄烟叶香气物质总量最高为606.53 μg/g，其余酵母无明显差异，均在500 μg/g 左右。而经过菌株C1 与酵母菌株混菌发酵后的雪茄烟叶与单菌发酵相比香气物质总量明显提高，其中以菌株C1 和汉逊酵母混菌发酵后的雪茄烟叶效果最显著，香气物质总量达到998.09 μg/g，为费比恩单菌发酵的1.6 倍。

经复合微生物混菌发酵后的雪茄烟叶挥发性香气物质种类没有变化，但含量显著提高，其中汉逊酵母和费比恩酵母处理后的雪茄烟叶苯甲醇含量明显高于其他处理组，菌株C1 更有利于美拉德反应产物以及苯丙氨酸转化产物的形成。