滇重楼叶片和花萼的SPAD值与叶绿素含量的相关性分析

骆亮仲，李卓蔚，周 浓，夏 李，付旭娟，黄 梅，郭冬琴

（重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404100）

滇重楼（Paris polyphyllavar.yunnanensis）作为延龄草科重楼属植物，是一种常见的名贵中药材，根茎入药，具有凉肝定惊、消肿止痛、清热解毒的功效，是“热毒清”“宫血宁”“季德胜蛇药片”和“抗病毒颗粒”等产品的主要原材料[1]，常用于治疗毒蛇咬伤、咽喉肿痛、跌打伤痛等病症[2]。近些年来，由于中药产业的迅速发展，市面上对滇重楼的需求大幅提升，导致大量野生滇重楼被采挖空，野生滇重楼的产量已不能满足人们的需求，因此，人工大规模种植高产优质的滇重楼刻不容缓。

植物光合作用离不开叶绿素，叶绿素含量直接影响绿色植株的光合效率，进而影响植株的营养状况和生长品质，是植物生长的一项重要指标[3]。目前对叶绿素含量的测定方法主要有SPAD 直接测定法和传统的丙酮浸提法，后者测定结果较精确，但测定时会损坏叶片，且操作复杂、耗时费力。而前者则可以在不破坏叶片完整性的情况下，快速准确地测定出植株叶绿素含量的相对值[4]，且不受外部环境的影响，因而此法逐渐被学者采用，已在荔枝、柞树、烟草、蕹菜和江孜沙棘等[5-9]植物中广泛应用。何丽斯等以高山杜鹃为试验材料，发现叶片内SPAD 值与叶绿素含量间存在显著相关性，可以用SPAD 值间接预测植株叶片的叶绿素含量，但大量数据显示，不同植株或是同一植株的不同部位，其拟合的数学模型仍存在着很大的差异性[10]。目前，关于滇重楼叶片内SPAD 值与叶绿素含量之间的关系尚未见报道，故本试验以不同生长年限的滇重楼叶片和花萼为供试材料，探究其SPAD 值与叶绿素含量之间的相关性，旨在为生产中利用SPAD 叶绿素仪估测滇重楼叶片营养状况提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

新鲜的滇重楼叶片采自于贵州省安顺市西秀区安顺学院科研实验基地，经安顺学院沈昱翔副教授鉴定为滇重楼。试验于2021 年9 月15 日10: 00—12: 00 进行采样，随机选取不同生长年限的植株各10株，每个植株摘取1 片长势较好、无病虫害的叶片和花萼，先用SPAD 叶绿素仪测量3 次，并记录数据；再将其摘下，做好标记，闭光、低温保存，采用丙酮法测定其叶绿素含量。

1.2 测定方法

1.2.1 SPAD直接测定法

采用叶绿素含量测定仪（CCM200 型）测定叶片和花萼的顶部、中部、底部的SPAD 值，测定时应注意避开叶片的损伤部位，以保证结果的准确性，求取平均值。

1.2.2 丙酮法测定

将上述测定的新鲜叶片和花萼表面擦净，将其摘下并做好标记，低温避光保存，除去叶中脉后剪碎。称取0.1 g 供试样品放入研钵中，80%丙酮研磨成匀浆，离心机4 000 r·min-1离心15 min，将上清液用80%丙酮定容至20 mL 待测。以80%丙酮为对照，采用紫外分光光度计测定波长645、663 nm 处的OD 值，代入公式计算其叶绿素a、b和总叶绿素含量[11-14]：

式中，Ca、Cb、Ct代表叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量，mg·g-1；D663和D645代表对应波长下的吸光度值；v代表定容体积，mL；W代表称样重量，g。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 22.0 软件处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 滇重楼叶片、花萼的SPAD值和叶绿素含量比较

比较不同生长年限滇重楼叶片、花萼的SPAD 值和叶绿素含量，结果见图1、图2。由图1 可知，随着种植年限的增加，滇重楼叶片SPAD 值和叶绿素含量的变化趋势几乎不同，其中SPAD 值表现为先增加后减少，而叶绿素a 和总叶绿素含量表现为先增加后减少再增加，叶绿素b 含量则表现为先减少后增加，其中，2 年生的叶绿素b 含量最高，4 年生的SPAD 值、叶绿素a 和总叶绿素含量最高。由图2 可以看出，随着种植年限的增加，滇重楼花萼的SPAD 值与叶绿素含量都表现为先降低后增加，其中4 年生的SPAD 值、叶绿素b 和总叶绿素含量最高，7 年生的叶绿素a 含量最高。通过比较两图可以看出，叶片SPAD 值和叶绿素含量均显著高于花萼。

图1 滇重楼叶片SPAD值和叶绿素含量比较

图2 滇重楼花萼SPAD值和叶绿素含量比较

2.2 滇重楼叶片、花萼的SPAD 值与叶绿素a 含量的相关性分析

由表1 得知，不同生长年限滇重楼叶片、花萼的SPAD 值与叶绿素a 含量之间表现出极显著相关性，所有函数模型的相关性均达0.4 以上，其中以5 年生（叶片）的函数相关性最大，相关系数高达0.958 4。根据相关系数大小，确定适用于二年生（叶片）、四年生（花萼）、四年生（叶片）、五年生（花萼）、五年生（叶片）、七年生（花萼）、七年生（叶片）的最优函数方程分别为对数方程y=0.351 7ln(x)-0.897 8（R²=0.713 2）、指数方程y=0.228 0e0.0249x（R²=0.539 1）、对数方程y=0.294 4ln(x)-0.644 1（R²=0.925 7）、指数方程y=0.163 2e0.0365x（R²=0.879 3）、指数方程y=0.194 6e0.0151x（R²=0.958 4）、线性方程y=0.013 4x+0.127 8（R²=0.607 4）、指数方程y=0.082 8e0.0476x（R²=0.836 4）。

表1 SPAD值与叶绿素a含量的4种函数关系模型

2.3 滇重楼叶片、花萼的SPAD 值与叶绿素b 含量的相关性分析

由表2 可知，不同生长年限滇重楼叶片、花萼的SPAD值与叶绿素b含量之间呈极显著相关，总体相关性均在0.5 以上，其中5 年生滇重楼叶片的SPAD 值与叶绿素b 含量的相关性最大，相关系数高达0.978 5。根据相关系数大小，确定适用于二年生（叶片）、四年生（花萼）、四年生（叶片）、五年生（花萼）、五年生（叶片）、七年生（花萼）、七年生（叶片）的最优函数方程分别为对数方程y=1.178 1ln(x)-0.498 6（R²=0.875 0）、指数方程y=1.895 0e0.0230x（R²=0.806 1）、对数方程y=2.231 6ln(x)-4.625 0（R²=0.965 5）、线性方程y=0.059 0x+1.426 1（R²=0.916 8）、对数方程y=1.590 4ln(x)-2.838 5（R²=0.978 5）、对数方程y=2.860 0 ln(x)-5.680 0（R²=0.677 3）、线性方程y=0.131 6x-0.705 2（R²=0.893 5）。

表2 SPAD值与叶绿素b含量的4种函数关系模型

2.4 滇重楼叶片、花萼的SPAD 值与总叶绿素含量的相关性分析

采用4 种函数对SPAD 值（x）和总叶绿素含量（y）的关系进行拟合，结果见表3。由表得知，不同生长年限滇重楼叶片、花萼的SPAD 值与总叶绿素含量之间呈极显著相关性，总体相关性均在0.6以上，其中5 年生滇重楼叶片SPAD 值与总叶绿素含量的相关性最大，相关系数高达0.978 8。根据相关系数大小，确定适用于二年生（叶片）、四年生（花萼）、四年生（叶片）、五年生（花萼）、五年生（叶片）、七年生（花萼）、七年生（叶片）的最优函数方程分别为对数方程y=1.529 1ln(x)-1.394 9（R²=0.871 6）、指数方程y=2.124 7e0.0232x（R²=0.839 6）、对数方程y=2.525 0ln(x)-5.267 2（R²=0.968 5）、线性方程y=0.068 8x+1.564 7（R²=0.920 7）、乘幂方程y=0.442 7x0.5482（R²=0.978 8）、对数方程y=2.941 1ln(x)-5.503 8（R²=0.731 1）、线性方程y=0.150 7-0.922 4（R²=0.905 2）。分析比较表3、表4 和表5 可以得出，不同生长年限的滇重楼叶片、花萼的SPAD 值与叶绿素含量的相关性大小总体都表现为：总叶绿素＞叶绿素b＞叶绿素a，且最大相关性均为5 年生滇重楼的叶片。

表3 SPAD值与总叶绿素含量的4种函数关系模型

2.5 滇重楼叶片SPAD 值、叶绿素含量的实测值与预测值比较

滇重楼叶片SPAD 值和叶绿素含量测定结果如表4所示，2 年生叶片SPAD 值变化范围为18.433～67.433，叶绿素a、b 和总叶绿素含量的变化范围为0.121～0.563 mg·g-1、2.969～4.372 mg·g-1和3.089～4.933 mg·g-1；4年生叶片SPAD值变化范围为28.533～73.233，叶绿素a、b 和总叶绿素含量的变化范围为0.324～0.630 mg·g-1、2.588～4.812 mg·g-1和2.910～5.440 mg·g-1；5年生叶片SPAD值变化范围为22.967～65.233，叶绿素a、b 和总叶绿素含量的变化范围为0.275～0.529 mg·g-1、2.201～3.763 mg·g-1和2.475～4.291 mg·g-1；7年生叶片SPAD值变化范围为23.133～41.600，叶绿素a、b 和总叶绿素含量的变化范围为0.240～0.635 mg·g-1、2.511～4.969 mg·g-1和2.750～5.602 mg·g-1。

表4 滇重楼叶片SPAD值、叶绿素含量的实测值与预测值比较

（续表4）

将测得的不同生长年限滇重楼叶片的SPAD值代入线性回归方程中，计算叶绿素的预测值，再对实测值与预测值进行统计学检验。由表5可知，p值均大于0.05，这说明不同生长年限滇重楼叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素实测值与预测值间差异不显著，因此可采用线性回归方程来预测滇重楼叶片叶绿素含量的绝对值。

表5 滇重楼叶片叶绿素实测值与预测值的P值结果

2.6 滇重楼花萼叶绿素含量的实测值与预测值比较

由表6 可知，4 年生滇重楼花萼SPAD 值变化范围为10.067～20.267，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量变化范围为0.288～0.552 mg·g-1、2.482～4.032 mg·g-1和2.770～4.533 mg·g-1；5 年生滇重楼花萼SPAD 值变化范围为4.533～20.567，叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量的变化范围为0.202～0.366 mg·g-1、1.800～2.622 mg·g-1和2.001～2.979 mg·g-1；7年生滇重楼花萼SPAD值变化范围为11.933～25.533，叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量的变化范围为0.260～0.689 mg·g-1、0.771～3.726 mg·g-1和1.196～4.217 mg·g-1。

表6 滇重楼花萼SPAD值和叶绿素含量的实测值与预测值比较

将测得的不同生长年限花萼的SPAD 值代入线性回归方程中，计算得出叶绿素的预测值，再对实测值与预测值进行统计学检验。由表7 可知，p值均大于0.05，这说明不同生长年限滇重楼花萼的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素实测值与预测值之间的差异不显著，因此可采用线性回归方程来预测滇重楼花萼叶绿素含量的绝对值。

表7 滇重楼花萼叶绿素实测值与预测值的P值结果

由表4 和表6 可以看出，不同生长年限滇重楼叶片、花萼的SPAD 值和叶绿素含量都各不相同，但叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量大体上都是随着SPAD 值的变化而变化，即SPAD 值与叶绿素含量的变化趋势保持一致。

3 小结与讨论

SPAD 叶绿素仪是通过测定绿叶在630、690 nm 两段波长处的吸光率来评估绿叶中叶绿素相对含量的一种手段[15]，在这两段波长下叶绿素对光的吸收不同，因此可以对叶片传输光的数量进行计算，由此得出SPAD 值。采用SPAD 叶绿素仪对植株叶片的叶绿素含量进行估测，不仅可以省时省力，测定还不受温度和气候等外部环境因素的影响，在测定过程中也不会对叶片造成损伤[16]。因此，现如今许多科研工作者都开始采用这种简单的测量方法来取代传统的紫外分光光度计测量法，也收获了不少成果，但用此法对滇重楼的研究还未见报道[17-18]。

本研究通过计算滇重楼叶片、花萼叶绿素的相对含量和绝对含量，发现不同生长年限滇重楼叶片和花萼的叶绿素含量各不相同，总体来看，叶片的叶绿素含量普遍高于花萼，这与高成杰等[19]的研究结果类似。但4 年生的滇重楼，不管是叶片还是花萼，叶绿素含量均高于其他年生，可能是因为受到气候、土壤、微环境及生长年限等条件的影响[19-21]，可能4 年生滇重楼植株是一个转折点，有待进一步从光合特性、生理生化等方面深入研究其机制。通过线性、指数、对数和乘幂四个回归方程[22-24]对叶片、花萼的SPAD值和叶绿素含量进行拟合，发现上述4种函数方程的拟合变量因子均达到极显著相关性，这说明SPAD值与叶绿素含量间呈极显著正相关，这与对甘蓝、油菜、甜瓜、红枫等[21,25-26]的研究结果一致。通过对滇重楼叶片、花萼的实测值与预测值进行方差检验，发现实测值与预测值间差异不显著，这与潘静[27]和李田等[28]的研究结果一致，表明无论是滇重楼的叶片还是花萼均可采用SPAD 值表示叶绿素含量，并且通过相应的回归方程，可以求出叶绿素含量的绝对值。

本研究表明，可以采用SPAD 叶绿素仪代替复杂繁琐的传统手段来测定滇重楼叶片和花萼的叶绿素含量，这为滇重楼叶绿素含量测定提供了便捷的手段，也为滇重楼的高效种植模式和田间栽培管理提供理论依据。