基于网络药理学探讨心力康颗粒治疗慢性心力衰竭的作用机制

余长志,来 于,付 蔷,刘建峰,梁红霞,都文渊,吴红金

慢性心力衰竭是由各种心血管疾病导致心室充盈或射血功能受损而引起的一组临床综合征,是心血管疾病的终末期表现和主要死因。《中国心血管健康与疾病报告2020概要》[1]显示,我国35岁以上的成年人中,心力衰竭患病率约为1.3%,较2000年增加了44.0%。随着医疗事业的发展,心力衰竭已逐渐发展为多学科、中西医结合的治疗模式,与传统单纯西药治疗相比,中西医结合治疗可改善病人症状、提高生命质量[2]。心力康颗粒是吴红金教授在多年临床实践的基础上,精心研制的治疗心力衰竭的专利方,由丹参、红参、川芎、附子、葶苈子、淫羊藿、红景天、冰片、延胡索组成,具有益气温阳、化瘀利水、通窍止痛的功效。本研究基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)探讨心力康颗粒治疗慢性心力衰竭的作用机制并提供理论预测,以期为心力康颗粒的进一步实验研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 心力康颗粒有效成分的搜集及靶点预测 通过TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)依次检索心力康颗粒中的8味中药(丹参、红参、川芎、附子、葶苈子、淫羊藿、冰片、延胡索),并设置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、脂水分配系数对数值(AlogP)≤5、类药性(drug-likeness,DL)≥0.18筛选出心力康颗粒的有效成分;通过中医药百科全书数据库(ETCM,http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/index.html)、中药综合数据库(TCMID,http://119.3.41.228:8000/tcmid/search/)和SwissADME平台(http://www.swissadme.ch/)筛选出红景天的有效成分[3-4]。通过TCMSP对有效成分进行靶点预测获取药物靶点蛋白。利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将靶点蛋白转化为对应的简称基因名。

1.2 慢性心力衰竭靶点搜集 分别检索在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM,http://omim.org/)、基因名片数据库(GeneCards,https://www.genecards.org/)、遗传药理学和药物基因组学数据库(PharmGKB,https://www.pharmgkb.org/)、治疗靶点数据库(TTD,http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/),设置关键词为“chronic heart failure”获得慢性心力衰竭相关靶点。然后利用R x64 4.0.2软件制作韦恩图,去掉重复靶点。

1.3 心力康颗粒与慢性心力衰竭交集靶点的筛选 获取所有心力康颗粒和慢性心力衰竭的靶点后,利用R x64 4.0.2软件和“venn”安装包绘制心力康颗粒药物有效成分靶点与慢性心力衰竭靶点交集韦恩图。

1.4 心力康颗粒复方调控网络的构建 获取药物有效活性成分靶点和交集靶点后,采用Cytoscape 3.8.0软件制作“药物有效活性成分-交集靶点”网络图。

1.5 关键靶蛋白相互作用(PPI)网络构建 将心力康颗粒治疗慢性心力衰竭的潜在靶点导入STRING数据库,设定物种为人,置信度≥0.9,将获得的文本数据整理并导入Cytoscape 3.8.0软件构建PPI网络。使用插件CytoNCA,以中介中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、点度中心性(degree centrality,DC)、特征向量中心性(eigenvector centrality,EC)、局部平均连接度(local average connectivity,LAC)、网络中心性(network centrality,NC)作为筛选条件,利用R x64 4.0.2软件在Cytoscape 3.8.0中筛选出每项评分都大于中位线的基因绘制PPI网络图。

1.6 基因本体(GO)富集分析 运用R x64 4.0.2软件中的“colorspace”“stringi”“ggplot2”“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”安装包对心力康颗粒抗慢性心力衰竭的交集靶点的分子功能(molecular function,MF)、生物过程(biological process,BP)和细胞组成(cellular component,CC)进行富集分析,设置P≤0.05。

1.7 京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 在R x64 4.0.2软件中,根据P≤0.05、Q≤0.05进行KEGG富集通路分析,通过“pathview”安装包绘制相关性高的生物通路图。

2 结 果

2.1 心力康颗粒有效成分及靶点 共获得心力康颗粒有效活性成分864个,其中,丹参202个,红参74个,附子65个,淫羊藿130个,川芎189个,延胡索77个,葶苈子68个,冰片31个,红景天28个。进一步筛选获得有效活性成分158个,详见表1;获得中药有效活性成分的靶点共229个。

表1 心力康颗粒158个有效活性成分相关信息

(续表)

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2.2 慢性心力衰竭相关靶点和药物有效活性成分靶点的交集 共获得慢性心力衰竭靶点9 414个(见图1)。与229个心力康颗粒有效活性成分靶点基因取交集获得心力康颗粒治疗慢性心力衰竭的交集靶点222个(见图2)。

图1 慢性心力衰竭基因靶点交集韦恩图

图2 中药有效活性成分靶点与慢性心力衰竭靶点的交集韦恩图

2.3 有效活性成分-交集靶点网络的构建与分析 应用Cytoscape 3.8.0软件以9味药物、158个有效成分的222个作用靶点为基础构建出“有效活性成分-交集靶点”网络图(见图3)。网络中共涉及347个节点、1 883条边,其中圆形代表活性成分,长方形代表靶点,活性成分中绿色代表淫羊藿,红色代表川芎,橙色代表丹参,黄色代表附子,粉色代表红参,淡蓝色代表葶苈子,深蓝色代表延胡索,紫红色代表红景天。从图3中可知ID为MOL000098的分子即槲皮素(quercetin)的靶点最多,为136个;ID为MOL000006的分子木犀草素(luteolin)靶点为54个;ID为MOL000422的分子山柰酚靶点为53个;ID为MOL007154的分子丹参酮ⅡA靶点为36个,这些成分可能对心力康颗粒药理功能的发挥较为重要。

2.4 PPI网络构建与分析 将222个关键靶蛋白导入STRING数据库,限定物种为人,设定置信度≥0.9,在Cytoscape 3.8.0软件构建PPI网络(见图4),该网络共涉及195个节点和954条边,节点代表靶点,边代表蛋白与蛋白之间的相互作用。然后在Cytoscape 3.8.0中使用插件CytoNCA,对BC、CC、DC、EC、LAC、NC进行打分,>中位数者予以保留进行第1次筛选(见图5),然后在第1次筛选的基础上同样以≥中位线为条件进行第2次筛选(见图6)。最终筛选出的核心靶基因为雌激素受体1(ESR1)、CXC趋化因子配体8(CXCL8)、信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)、淀粉样前体蛋白(APP)、视网膜母细胞瘤基因(RB1)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、肿瘤抑制因子p53(TP53)、致癌c端细胞周期蛋白D1(CCND1)、原癌基因(JUN),这些靶点与其他蛋白相互作用较强。

2.5 GO功能富集分析 通过R语言对关键核心靶点进行GO分析,预测靶点涉及的MF主要富集于药物的细胞反应、金属离子反应、对外缘化合物刺激的反应、脂多糖反应、对菌缘性分子的反应、细胞对化学应力的反应、对类固醇激素的反应、对抗生素的反应、对氧水平的反应、对营养水平的反应;涉及CC的主要有膜筏、膜微结构域、膜区、突触后膜、突触后膜的组成成分、陷窝、突触后膜的内在成分、突触膜的组成成分、质膜筏、神经元胞体;涉及BP的主要富集于神经递质受体的活性、核受体的活性、配体激活的转录因子活性、G蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素能受体的活性、突触后神经递质受体活性、儿茶酚胺结合、类固醇激素受体活性、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA-结合转录因子结合、DNA-结合转录因子结合。MF、BP和CC中排名前10位的见图7。

2.6 KEGG通路富集分析 利用R语言挖掘分析获得排名前30位的富集通路,其中与心力衰竭相关的10个主要通路为:磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路、人巨细胞病毒感染、液体剪切应力和动脉粥样硬化、刺激神经组织的配体-受体相互作用、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎、MAPK信号通路、晚期糖基化终末产物/晚期糖基化终末产物受体(AGE/RAGE)信号通路在糖尿病并发症中的作用、丙型肝炎、Epstein-Barr病毒感染(见图8)。同时在R语言软件中通过“pathview”安装包绘制心力康颗粒调节PI3K/AKT信号通路(见图9)和流体剪切应力与动脉硬化信号通路(见图10)的生物过程,其中红色表示该通路涉及的与心力康颗粒有关的关键靶基因,如PI3K/AKT信号通路中的P53、CCND1、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、AKT等基因,流体剪切应力与动脉硬化通路中的血管内皮生长因子受体(VEGFR)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p53、eNOS、白细胞介素(IL)-1等基因。

图8 KEGG通路富集分析气泡图

图10 心力康颗粒调节流体剪切应力与动脉硬化信号通路图

3 讨 论

本研究结果显示,在药物有效活性成分-交集靶点网络图中,中心性较高并且应用于心血管领域研究的有槲皮素、木犀草素、山柰酚和丹参酮ⅡA。在心力康颗粒中,槲皮素是葶苈子、淫羊藿、延胡索3味药的共有成分,研究发现,槲皮素具有抗氧化、抑制炎症、降低血压、加快脂质代谢的作用,可通过恢复氧化还原平衡和保护线粒体来逆转心肌肥厚[5-6]。木犀草素是丹参、淫羊藿中含有的化学成分,是一种黄酮类化合物,通过激活PI3K/AKT信号通路抑制内质网应激诱导的细胞凋亡,保护线粒体功能和抗氧化应激对心肌发挥保护作用;激活p53信号通路、下调p53蛋白的表达、抑制细胞凋亡和保护线粒体,发挥抗心力衰竭作用[7]。此外,木犀草素通过调节肌浆网Ca2+-ATP酶2a,调控心肌细胞内Ca2+的平衡,改善心力衰竭大鼠的心功能[7]。山柰酚是葶苈子、淫羊藿、红景天的共有成分,是一种具有抗炎、抗氧化作用的黄酮类化合物,其通过调节核因子-κB(NF-κB)/MAPK和5-单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/核因子E2相关因子(Nrf2)通路显著降低AngⅡ刺激的心脏成纤维细胞的炎症和氧化应激,预防AngⅡ诱导的心脏重构[8];山柰酚还可通过调节异丙肾上腺素诱导的心力衰竭糖尿病大鼠Nrf2、NF-κB、PI3K/AKT/糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)信号通路对心脏发挥保护作用[9]。丹参酮ⅡA是丹参的一种主要有效成分,可通过抗氧化应激减轻心肌梗死小鼠的心力衰竭,改善左室射血分数,减缓、逆转心室重塑[10]。此外,红参、附子中的人参皂苷和乌头生物碱也对心脏有保护作用,有研究发现,参附注射液通过抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6及sFas等凋亡相关因子减少心肌细胞凋亡,改善梗死后心力衰竭大鼠的心功能,对心肌细胞发挥保护作用[11]。

PPI网络直观展示心力康颗粒中多靶点相互作用抗心力衰竭的特点。经过两次筛选之后,核心靶基因为:CXCL8、STAT3、RB1、MAPK1、TP53、CCND1、JUN。CXCL8是一种作用于CXCR1和CXCR2受体的趋化因子家族成员,研究表明CXCL8在ST段抬高型心肌梗死后心力衰竭的发生中发挥重要作用,可以控制中性粒细胞浸润,介导心肌梗死后心脏的修复、重塑[12-13]。敲除大鼠RB1和Meis2基因阻断心肌细胞的衰老诱导通路,可以显著促进心肌细胞增殖,并在缺血损伤的情况下加强对心功能的保护[14]。MAPK1是一类丝氨酸蛋白激酶,属于MAPK家族的一员,可将细胞外信号转导至细胞内,参与增殖、分化、转录调节多个生物过程,通过抑制细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)/MAPK信号通路及调节氧化应激防止心肌肥厚,对冠心病和心力衰竭有治疗作用[15]。STAT3在心脏中具有多种细胞功能,包括使分化、成熟的心肌细胞损伤后重新进入细胞周期,病理条件下抗凋亡等,一种心肌再生治疗策略就是使用人工受体触发内源性STAT3信号激活,对心脏进行再生治疗[16]。TP53及其下游靶基因TP53诱导的TIGAR可调节心脏代谢和细胞周期,国外一项研究首次证明了TP53诱导的TIGAR在实验性心力衰竭小鼠心肌中上调,敲除TIGAR可以保护心力衰竭时的心功能和心肌能量[17]。CCND1即致癌c端细胞周期蛋白D1,CCND1是miR-93的直接靶点,miR-93/CCND1信号通路的失调与心室重构的发展有关[18]。JUN是一种癌蛋白基因,研究发现c-Jun与防止应激引起的心脏不适应性重塑相关[19]。

GO富集分析发现BP富集多与炎症相关,CC多涉及神经系统,MF方面较多富集于神经受体,每种功能富集多个基因,说明心力康颗粒相关靶点通过多种分子功能发挥作用。KEGG信号通路富集分析中,发挥主要作用的通路有PI3K/AKT、流体剪切应力和动脉硬化、IL-17及p53信号通路。PI3K/AKT通路通过一系列分子调控参与细胞的增殖、凋亡,与心力衰竭及心肌纤维化的发生、发展和病理过程密切相关[20]。p53是一种肿瘤抑制蛋白,其介导的线粒体自噬抑制可调节心功能不全,通过抑制细胞质p53来激活线粒体自噬,改善心力衰竭和心脏衰老症状[21]。流体剪切力与动脉硬化信号通路在调节血管内皮细胞功能中发挥重要作用,研究发现,流体剪切力可使血管紧张素转换酶Ⅱ增多,抑制内皮细胞增殖和炎症反应,并促进一氧化氮的产生,对心力衰竭的发生发展进行调节[22]。虽然IL-17信号通路、TNF等信号通路在KEGG气泡图中排名并不靠前,但在心力衰竭的病程中也有重要影响,IL-17可以抑制心肌纤维化的心脏重建,并通过调节TNF受体相关因子6、NF-κB诱导激酶等通路发挥抗心力衰竭作用,而TNF-α的高表达与心肌损伤和心功能紊乱相关[23-25]。

本研究基于网络药理学技术,利用整合药理学平台,建立了心力康颗粒成分靶点-慢性心力衰竭靶点的分子生物网络,对心力康颗粒的生物功能和作用通路进行了分析,从多方面探索心力康颗粒治疗慢性心力衰竭的作用机制。结果表明,心力康颗粒中的有效成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹参酮ⅡA等可能主要通过ESR1、CXCL8、STAT3、APP、RB1、MAPK1、TP53、CCND1、JUN等关键基因靶点,调控PI3K/AKT、流体剪切应力和动脉硬化、IL-17、TNF、p53等多条信号通路调节凋亡因子和炎性因子等相关因子,控制心肌细胞增殖分化进程,干预线粒体自噬,抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和心脏重建等机制发挥治疗心力衰竭作用。在心力康颗粒治疗心力衰竭的KEGG信号通路分析中,出现与肝癌、小细胞肺癌、胰腺癌等多条癌症相关信号通路,说明心力康颗粒在肿瘤心脏病学领域具有的潜在研究价值。然而,本研究中心力康颗粒各药物有效成分的筛选条件是AlogP≤5、OB≥30%、DL≥0.18,OB较低的化合物(如多酚的OB只有10%、人参的OB不到5%)更加容易到达结肠,经肠道微生物的转化发挥药理作用[26]。因此,本研究尚存在不足,并不能全面预测心力康颗粒治疗慢性心力衰竭的作用机制,具体机制和物质基础有待更深入的实验研究加以验证。