畜牧兽医领域的基因敲除技术

童超，刘官源

（余干县农业农村局，江西 余干 335100）

畜牧业是我国经济社会发展中的重要内容，并且随着人们生活质量不断提升，对于牛羊肉、禽肉、乳制品的需求量也不断增加，因此为满足人们生活的基本需求，则要保证我国畜牧业的稳定发展。而畜牧兽医工作对于畜牧业的发展起到了关键性的作用，其能够不断完善防疫体系以及提高地方畜牧业生产力，本文则主要针对畜牧兽医领域的一种基因修饰技术——基因敲除技术展开研究。

1 基因敲除技术内涵

基因敲除技术是指将生物的受体细胞基因组以及DNA（脱氧核糖核酸）之中相近或者相同的序列基因同源组合，重构至受体细胞的基因组之中，并获得表达的一种外源DNA 导入技术。其运作原理是：在基因的某个序列已知但功能未知的状态之下，进一步改变生物遗传基因的结构，让其能够丧失某一种特定的功能，当此功能被屏蔽了以后，就可以对生物体造成一定的影响，便于对生物基因的生物学功能进行推测，在畜牧兽医领域主要应用于动物的基因修饰与模型建立。

2 畜牧兽医领域基因敲除技术的研究历程与分类

2.1 研究历程介绍

在20 世纪80 年代，基因同源重组技术和胚胎干细胞技术得到了快速的发展，在此技术之上，衍生出了基因敲除这种全新的分子生物技术。到了20 世纪90 年代，基因敲除与嵌入技术成了畜牧兽医领域的最新外源DNA 导入技术，而基因敲除技术也是基因打靶技术之中的一种，与基因同源重组之间有着较多的相似之处。通过该种方法可以使得基因的突变更加具有精准度和指向性，也可以纠正一些机体的基因突变问题，能够有效解决牲畜随机组合的盲目性以及偶然性。

2.2 技术分类解析

当前基因敲除技术主要分为两种形式：一种是不完全性基因敲除技术，另一种则是完全性基因敲除技术。不完全性基因敲除技术是指相关技术人员通过重组与定位系统的方式，从而在特定的空间以及时间之内，将基因进行敲除。当前主要的重组与定位系统有四种形式，分别为：Cre/LoxP 系统（噬菌体），Gin/Gix 系统，FLP/FRT 系统（酵母细胞），R/RS 系统。完全性基因敲除技术是指利用同源重组的方式，从而将细胞或者动物个体之中的靶基因活性完全敲除。

3 基因敲除技术在畜牧兽医领域的具体应用形式

3.1 基本操作步骤

在畜牧兽医领域，通过基因敲除技术，对动物进行转基因行为的操作流程可以参考图1：

图1 基因敲除操作步骤

第一步，获得干细胞。基因敲除技术起初的实验对象是鼠类，鼠品系129 及其杂合体是理想的实验动物。通过试验证明该种技术，对鼠品系的基因敲除技术，也可以应用于其他畜牧动物身上，并具有良好的成效。动物的远交系遗传背景十分复杂，在实验的过程中结果往往不够理想，并且在进行基因敲除的步骤之中，由于回交次数的不同，最终结果的重复性不佳。因此，为解决制作动物模型标准不够统一的情况，则要直接利用C57BL/6 ES 细胞进行基因敲除的实验，以便可应用于畜牧兽医领域工作之中动物的免疫学、神经学研究以及疾病治疗。

第二步，载体的构建。基因敲除的载体是由目的基因与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子重组带入到标记基因载体中构成的，在进行敲除的过程中所要实施的目的不同，因此在载体的设计上也有许多不同的设计方法，例如插入型载体或者替换性载体。依照实验目的不同，其所要敲除的载体也分为全基因敲除、不完全基因敲除、基因敲入或者诱导性基因敲除等多种形式。

第三步，基因的导入。在基因导入环节，畜牧兽医领域多使用电穿孔的方式开展，虽然注射命中概率要较低一些，但便于使用。相比而言，显微注射命中概率就会更高一些，但是难度也较大，对于技术人员的专业要求较高。而进行基因导入这一步骤的主要原因在于需要将基因敲除的载体通过以上两种形式导入到同源的ES 细胞之中，这样才能保证外源DNA 和ES 基因组之中的对应部分发生反应，通过同源重组，能够将载体之中的DNA 与内源基因组整合，从而得以表达。在筛选的过程中会利用培养基开展，使用方法共分为两种形式，一是正选择法（选择群体中生存能力与育性较高的个体，并留下子代，扩散至整个群体中）；二是负选择法（当群体之中出现了不利基因时，携带该种基因的个体将会在群体中淘汰），利用白喉毒素A 亚基（DTA）进行阴性筛选，然后将其导入到动物的囊胚之中，所得到的囊胚将会被植入到假孕动物的体内，最终发育成为嵌合体动物。

第四步，性状的改变。通过观察嵌合体动物并加大对其生物学性状的研究，了解动物在基因敲除以前和基因敲除以后所产生的变化，才能真正地获得目的基因。当前在畜牧兽医领域之中的牛、羊、猪等大型哺乳类动物身上，利用此种方法，均能够改善动物的基因，但犬类的生殖以及生理特点较为特殊，因此需要通过自体移植的方式，从而解决犬类的基因敲除问题。

3.2 动物模型建立

通过对鼠类的测试，使得大型的畜牧哺乳类动物和家禽类等在基因敲除方面有了重大的突破，并且通过对相关动物的生物学性状与机理进行观察，发现与人类的遗传性疾病也有着许多的相似之处。例如：在对In-certi 敲除小鼠OA1 的实验之中，据观察发现，小鼠的眼球底部存在黑色素不足的情况，这与其他动物和人类的眼白化病1 型发病机制有着较强的相似性，因此在后期的实验过程中可对动物基因之中的此部分进行敲除，建立一个机能较好，并且少有遗传性疾病的动物模型。在进行实验的过程中还发现通过对实验体的LDL 受体以及载脂蛋白E 基因进行敲除，能够有效解决动物的早期心脏病问题，应用于畜牧兽医领域之中，能够进一步提升动物模型建立的质量。

3.3 功能基因组学的研究

就功能基因重组方面而言，通过相关实验以及文献资料表明，对动物的P53 以及P21 基因进行敲除，最终所建立的模型能够起到调节细胞周期的作用，不仅如此，还可以对克隆的细胞实现修复作用，因此应用于相关畜牧动物的身上，可以提高动物的代谢能力，减少疾病的出现。部分畜牧动物由于长期的劳作以及所处生长环境较为复杂，提前出现了衰老的迹象，这也使得所饲养动物的经济价值降低，并且也为兽医的防疫工作提高了难度。然而，在实验的过程中发现，导致这一问题出现的基因为K1，在重组的过程中则可以通过ApoE（载脂蛋白E）培育转化出生长因子B1 基因动物的方式，从而有效调节动物的淋巴细胞增生能力，强化动物的基因质量，进一步推动地方畜牧业生产力的提升。

3.4 药理学的研究

在药理学之中应用基因敲除技术的主要原因在于，动物的基因以及所处的生长环境不同，即便是处于同一生长环境之内，当出现疾病时，兽医治疗的效果也是具有差异的，而为了能够提高治疗与防疫工作的实效性，可以寻求新的治疗方法，需要将基因敲除技术与药理学进行研究，从而对动物的基因状况进行改善，使得动物能够充分吸收药物，快速痊愈。例如：在检查的过程中许多动物的身上都存在寄生虫，通过CRISP/Cas 基因敲除技术，则能够进一步抑制动物身上的寄生虫生长，并且对于弓形虫的感染有着显著的治疗效果。

3.5 免疫学的研究

无论是对于人类还是动物而言，其免疫系统是重要的机体执行模块，就畜牧领域的动物来说，对其所处的生长环境不能进行统一调控，很大程度上会受到经济、气候等客观因素的影响，因此只有保证动物的免疫系统稳定，才能够从根本上减少瘟疫和疾病类问题的出现。在此过程中也可以参照人类的免疫系统，对所养殖动物的免疫系统进行修复，从而最大程度地优化动物基因。例如：相关研究人员在实验的过程中，对实验体的K 青链恒定区CK 进行了基因敲除，并利用人体基因之中的CK 基因片段对其进行重构，结果在纯合体检测中，B 淋巴细胞内便出现了人的CK 抗体，进一步提高了动物的免疫系统抵御能力。

3.6 疾病预防治疗

不同动物的生理构造不同，因此在患病时，有许多动物存在特殊病状，有时很难在防疫的过程中达到预防和及时治疗的效果，此时可通过基因敲除技术解决相关问题。例如：在相关实验之中，小鼠很容易感染朊病毒，而通过对其Prion 基因进行敲除，有效改善了小鼠感染朊病毒的情况，并且也不存在其他的副作用。因此就畜牧兽医领域而言，可以通过基因敲除技术，来解决部分动物所存在的特殊病状问题，这样不仅可以提高该种动物的生长质量，还可以提升地方动物防疫水平。

4 畜牧兽医领域利用基因敲除技术应用案例分析

当前基因敲除技术在畜牧兽医领域的应用不仅起到了预防动物出现大规模疾病和改善动物基因的作用，还被广泛应用于对特定动物种类进行扩繁养殖，其不仅能够提高地方畜牧业的经济收入，改善农民的生活质量，还能够以新农村建设为基点，创建地方畜牧业特色，使畜牧动物能够充分适应当地环境。

4.1 技术应用的动因

以我国西北部欠发达地区畜牧业之中常出现的羊的扩繁问题为例，像宁夏等地区由于民族变迁史较为复杂，加之所处地理环境，则多以半农半牧为主，而滩羊就是该地常见的畜牧品种之一。滩羊的特点是在尾部积有大量的脂肪，而这也进一步影响到了羊肉的质量以及其繁殖能力，但由于滩羊肉的风味独特，并且膻味较淡，且裘毛皮具有柔韧性较强以及保暖性较高的特点，具有较高的经济价值。因此，为能够改善滩羊基因所存在的体格较小、生长发育迟缓以及繁殖能力较低等问题，可以通过基因敲除的方式，改善滩羊的基因，加快其繁殖效率，培养出体型较大、繁殖质量较高的品种，推动地方畜牧业的发展，改善地方牧民经济收入水平。

4.2 实验材料与方法

在进行实验以前，需要根据地方羊基因改良目标以及实验体的特点选定敲除的方式，因此此种基因敲除技术具有较强的目的性，采用了条件性定点敲入的方式，来改变滩羊的性状。其实验的材料分别为：①试验羊群。选择当地的一个繁殖场，并分为实验组以及对照组，主要选择的对象为具有繁殖能力的母羊，而在配种上则可以选择MSTN 基因敲除突变较为优质的公羊，例如M1500451、M1721、M172011 等。②实验设备主要有以下几种：生物显微镜、电子天平、电热鼓风干燥箱、水浴锅、冰箱、高压蒸汽灭菌器、羊用假阴道等。③在试剂的选择上主要有氯前列醇钠、孕马血清促性腺激素、青霉素等。

所采用的实验方法是先利用公羊母羊进行试情分类，然后进行分析处理与分类，并进行诱导发情，具体的数据信息可参考表1 内容。

表1 试情、母羊发情情况

表中“248”表示自然发情的母羊总数；“287”为试情母羊总数；发情周期不正常与不发情的母羊总共有39 只；两次诱导发情测试以后发情的母羊共有27 只。

4.3 实验结果与分析

在经过了第一次和第二次的诱导发情以后，最终共有275 只母羊发情，占最终发情母羊比例的95.82%，而在测试过程中仍有4.18%的母羊存在不发情的情况，出现这种情况可能是母羊自身基因问题和营养不良等情况所导致的，因此为能够进一步节约成本和实践经历，则建议在选定与重组的过程中淘汰此类母羊。并且基因敲除的阳性羊为72只，而其中有4 只的MSTN 基因敲除公羊后代的阳性占比均可以超过30%，而杂合体公羊的后代更具有增殖和快速生长的优势，因此在扩繁的过程中采用MSTN 基因敲除的滩涂羊个体阳性后代比阴性后代更有优势。

5 结语

综上所述，基因敲除技术是人类在20 世纪最伟大的发明之一，其克服了原有的牲畜随机整合的盲目性以及偶然性，能够从根本上解决部分畜牧牲畜所存在的基因疾病、适应能力差、繁育能力低等问题，对于提高地方的畜牧业生产力起到了关键性的作用。当前由于我国在畜牧兽医方面的高质量复合型技术人才缺口较大，此项技术还未被普遍应用，在未来其传播以及推广也是重点工作之一。