基于生物信息学分析TGFβ1在肝脏肝细胞癌中的表达及其预后价值

郑凯,袁仕国,欧阳怡佩,黄世稳

(1 .右江民族医学院基础医学院,广西 百色 533000;2. 海南省中医院,海南 海口 570203)

肝脏肝细胞癌(liver hepatocellular carcinoma,LIHC)占原发性肝癌的70%～90%,是全球癌症死亡的三大原因[1]。其发病机制尚不明确,临床观察显示其为肝脏长期慢性肝病的终末期[2]。研究表明[3-4],肝癌发生发展的分子机制可能是肝癌诊疗与预后评估的瓶颈。LIHC严重威胁患者的健康,虽然手术治疗已取得较好的成效,但预后效果仍很差[2]。因此,LIHC的治疗仍为目前全世界面临的难题。研究发现LIHC的相关基因对LIHC的早期诊断及预后十分重要。转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGFβ1)在机体大多数细胞中均可表达,广泛参与机体生物学进程,是在胚胎发育、正常生长发育、免疫调控和维持机体平衡中起主导作用的多功能蛋白,控制着多种细胞类型的增殖、分化、凋亡和其他功能[5]。许多细胞合成TGFβ1,并有专门的受体,它积极或消极地调节许多其他生长因子[6]。TGFβ1在包括肝癌在内的肝脏疾病的发生、发展中同样发挥主导作用[7-8]。因此,了解TGFβ1及其信号通路在肝脏疾病中的具体作用机制,对肝脏疾病的进一步研究及治疗具有重大临床意义。近年来TGFβ1参与LIHC并指示其预后价值的研究报道少见,故本研究拟通过多个数据库对TGFβ1基因进行数据挖掘,分析TGFβ1 在LIHC中的表达及其预后价值,为临床诊断和治疗提供有效的依据。

1 资料与方法

1.1研究方法

1.1.1分析TGFβ1在正常组织和泛癌中的表达差异 利用数据库TIMER 2.0的Cancer Explaoration 模块中的Gene DE界面进行泛癌和正常组织中TGFβ1中的表达差异情况检索,获取在泛癌组织和正常组织中的表达情况的方框图[9]。

1.1.2分析TGFβ1在LIHC中的差异表达 使用UALCAN数据库中的TCGA模块进行TCGA Gene分析TGFβ1在LIHC和正常组织中的表达差异情况。输入TGFβ1基因名并在TCGA窗口选择Liver hepatocellular carcinoma,选取Expression获取TGFβ在正常组织和LIHC中的表达差异,并就患者年龄、性别、肿瘤分级、淋巴转移情况、癌症分期、T53突变状态和组织学亚型分别分析TGFβ1在LIHC表达中的情况,分析TGFβ1 在不同临床病理特征中的差异表达[10-12]。

1.1.3分析TGFβ1与LIHC预后的关系 利用数据库Kaplan-Meier Plotter中mRNA系类组块中的Liver cancer模块,在Survival选项选取OS和RSF选项分析TGFβ1对LIHC患者总生存期的影响及无病生存期的影响,并绘制TGFβ1表达与生存关系KM的生存曲线[11-12]。

1.1.4构建TGFβ1蛋白互作网络以及进行功能富集分析 在数据库STRING中Protein Name输入TGFβ1,Organism选择Homosapiens进行检索,具体参数设定为:置信度为0.7,首级及次级互动蛋白数量分别选择不超过20和不超过10,绘制蛋白互作图并筛选出与TGFβ1基因的密切相关的基因[13]。将上述与TGFβ1紧密的互作基因输入DAVID 数据库,以FDR<0.05显著性作为富集标注将进行GO功能富集和KEGG通路功能富集及分析[14]。

1.2统计学方法 数据的统计学分析均采用数据库默认的统计学分析方法进行:TGFβ1在泛癌组织和正常组织中的表达水平差异,采用Wilcoxon检验(TIMER 2.0);TGFβ1在LIHC与正常组织中的表达水平比较,采用单因素方差分析(UALCAN数据库);TGFβ1高表达与生存率的比较,采用Logrank检验(TIMER 2.0)。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1TGFβ1在泛癌症中的表达情况 结果显示,TGFβ1在LIHC等多种癌症组织中相较于正常组织都有较高的表达,见图1。

注:与正常肝组织比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2TGFβ1在LIHC中的表达情况 TGFβ1在正常肝组织中的表达显著低于LIHC组织(P<0.001)。见图2。

2.3TGFβ1表达水平与患者临床病理学特征的关系 在UALCAN数据库中选择性别、年龄、体重、肿瘤分期、淋巴转移、个体癌症分期、T53突变状态及组织学亚型等方面进行相关性分析显示,TGFβ1在上述不同临床病理特征分期中存在差异表达。UALCAN结果显示,TGFβ1表达水平与患者的上述临床病理学特征有关,差异具有统计学意义(P<0.05),见图3。

2.4TGFβ1对LIHC患者生存期的影响结果 TGFβ1的表达与LIHC患者的总体生存率有关(P<0.05),总体上减短患者的总生存期。而对患者无病生存期并无统计学差异(P>0.05)。见图4。

注:TGFβ1在LIHC组织中与正常肝组织比较,***P<0.001。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

注:A为总生存期,B为无病生存期。

2.5蛋白互作网络与功能富集分析结果 结果发现30个蛋白与TGFβ1基因存在紧密互作关系(见图5)。TGFβ1的互作蛋白被用于GO和KEGG功能富集分析(见图6),其中KEGG富集的通路主要包括:癌症相关通路(hsa05200)、癌症中的蛋白聚糖(hsa05205)、TGFβ1信号通路(hsa04350)、转化生长因子受体β信号通路(GO:0007179)、FoxO信号通路(hsa04068)、AGE-RAGE信号通路(hsa04933)、乙型肝炎(hsa05161)、人类t细胞白血病病毒1感染(hsa05166)等信号通路。GO富集的通路包括:2个分子功能、5个细胞组分和7个生物学过程,其中分子功能包括:蛋白结合(GO:0005515)和同源蛋白结合(GO:0042802)。细胞组分包括:胞核(GO:0005634)、细胞表面(GO:0000086)、质膜(GO:0005886)及细胞内外区域(GO:0005615,GO:0005576)。生物学过程包括:参与TGβ1受体信号道路(GO:007179)、细胞增殖的负性调控(GO:0008285)、老化(GO:0007568)、转录正调控及DNA模板化(GO:0045893)、伤口愈合(GO:0042060)、正向调控RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控(GO:0045944)、缺氧反应(GO:0001666)。

图5 与TGFβ1基因存在紧密互作关系的蛋白

注:BP.生物学功能,CC.细胞组分,MF.分子功能,KEGG.信号通路。

3 讨论

研究表明,LIHC的发生是多因素、多机制的调控过程。其中,肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化在肝纤维化发生和发展过程中发挥关键作用[15],对于慢性肝病的进程以及发展为肝硬化和LIHC等终末期肝病的进程的调节非常重要[16],而TGFβ1是活化HSC的重要蛋白因子,在急慢性肝损伤发生的早期,肝脏的固有细胞即肝细胞、库普弗细胞(kupffe cell)及炎症反应招募的免疫细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等分泌TGFβ1。TGFβ1参与HSC活化发生的多条细胞通路,引起早期肝纤维化的发生[17]。LIHC的晚期,TGFβ1在加速肝纤维化的发生、促进肝癌细胞的增殖、肝癌干细胞的扩增、血管的异常增生等方面发挥促进作用[18-19]。同时,TGFβ1可抑制免疫应答,为肝癌细胞的增长创造肿瘤微环境[20];TGFβ1还可以增强水解蛋白与细胞黏附分子结合的活性,为肝癌细胞的侵袭及转移创造条件[21]。基于上述生理过程,TGFβ1对于LIHC的分子靶向治疗具有重要的价值,由此,TGFβ1具有重要的研究价值。本研究结果显示,TGFβ1在LIHC中的表达水平与正常组织相比较高。且高表达的TGFβ1与性别、年龄、体重、肿瘤分级、淋巴转移情况、个体癌症分期、组织学亚型及T53突变状态等都有关。进一步分析发现Smad2、Smad3、TGFβR1和TGFβR2等为TGFβ1的紧密互作蛋白,经功能富集分析,发现它们主要参与核酸转录调控、细胞增殖、老化、凋亡过程,是细胞核、质膜的组成成分,而且在癌症相关通路、癌症中的蛋白聚糖、TGFβ1信号通路、FoxO信号通路、AGE-RAGE等信号通路起作用。多种癌症的发生都与TGFβ1信号通路有关,TGFβ1信号通路已被证明与肝细胞癌[22]、结直肠癌[23-24]、非小细胞肺癌[25]的发病机制有关,还参与了慢性肾癌的发生发展[26]。FoxO信号通路是主要的神经活动信号通路,同时也是细胞癌变、癌症发生发展的重要通路,其促进了前列腺癌的进展[27]。而且TGFβ1的相关基因MMP2被发现介导直肠癌淋巴转移的发生[28],EP300被报道通过FBXW7-NOTCH-CCL2/CSF1轴改变肿瘤相关巨噬细胞极化,促进弥漫性大B细胞淋巴瘤的肿瘤进展[29]。由此可见,与TGFβ1紧密互作的这些蛋白大都与肿瘤的发生发展有关。

综上所述,TGFβ1基因可能是导致LIHC患者预后不良的危险因素。另外,SMRF2和TIMP1等多个基因与TGFβ1紧密相关,本研究可为进一步探讨LIHC发病机制以及预后价值提供一定的理论依据。