三七总皂苷对缺血性脑卒中肠道功能影响的探讨

2023-05-08 14:03陈维陈玉珍方子文杨林幅王国燮徐海平牙红连彭浩强蒙兰青
右江民族医学院学报 2023年2期
关键词:总皂苷绒毛屏障

陈维,陈玉珍,方子文,杨林幅,王国燮,徐海平,牙红连,彭浩强,蒙兰青

(1. 右江民族医学院研究生学院,广西 百色 533000;2. 右江民族医学院附属医院神经内科,广西 百色 533000)

脑卒中是常见的脑血管疾病,分为缺血性卒中和出血性卒中,其中缺血性卒中占80%[1],其发病机制复杂,不仅对中枢神经系统有影响,而且还影响胃肠道,如胃肠动力改变、便秘或大便性状改变、肠道黏膜受损等肠道结构功能损害[2]。胃肠道不仅受自身肠道信号调节,同时也受到中枢神经的调控;肠脑轴是肠道和大脑之间的双向信号传递和关联,在缺血性脑卒中的进展中肠脑轴具有重要作用,其中肠道屏障也是不可或缺的[3],因此保护肠道结构和功能对缺血性卒中治疗具有重要意义。

三七总皂苷是中草药三七的主要活性成分,实验及临床研究表明,三七总皂苷通过抗炎、抗氧化,保护血脑屏障等作用改善缺血性脑卒中再灌注损伤[4-5],发挥脑保护作用。三七总皂苷在缺血性脑卒中治疗中是否作用于肠道,保护肠道结构,改善肠道功能,目前少见报道。为此,本试验将探讨三七总皂苷对缺血性脑卒中后肠道结构和功能的影响,为三七总皂苷治疗缺血性脑卒中提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性SD大鼠(体重250~300 g,SPF级别)购自长沙天勤[动物合格证号:SCXK(湘)2019-0014]。将大鼠饲养在维持12 h光照/黑暗循环,环境温度保持在(24±2) ℃,湿度(55±15)%的屋子里,所有大鼠每天可自由饮水和进食,在实验开始前适应性的喂养大鼠7 d。

1.2动物卒中模型和分组 将36只SPF级SD大鼠随机分为3组:假手术组、模型组和治疗组,3组继续分为7 d和14 d两个亚组,每个亚组6只。将大鼠麻醉后,颈正中切开皮肤,分离肌肉及筋膜,分离右侧颈总动脉和颈内外动脉,结扎颈总动脉远端及颈外动脉近分叉口处,在颈总动脉开小口放入线栓栓塞颈内动脉,固定线栓,缝合颈部皮肤,2 h后取出线栓,观察大鼠。假手术组只开颈部皮肤,分离颈总动脉和颈内外动脉,不穿刺,然后缝合颈部皮肤。治疗组腹腔注射三七总皂苷(100 mg/kg剂量,每天1次,分别给药7 d和14 d),其他两组给予相同剂量的生理盐水。每天记录大鼠的体重和神经评分,神经功能评分按照Longa评分[6]:0分,无缺陷,活动正常,或提尾倒挂时大鼠双前肢对称伸向地面;1分,提尾时不能完全伸展病灶对侧前肢;2分,行走向对侧转圈;3分,站立不稳、向偏瘫侧倾倒;4分,不能主动行走,意识丧失。1~3分视为制模成功。

1.3组织学检查 取出大鼠小肠1 cm,用多聚甲醛固定并包埋在石蜡中,切成3 μm切片,然后用苏木素和伊红染色,在光学显微镜下由病理医生在不知情的情况下评分,小肠黏膜损伤以Chiu’s为评分标准[7]。黏膜损伤的Chiu病理评分量表用于评估每个1 mm的10个切片的组织学改变程度,然后取平均值。量表由0~5的值组成,其中0为正常小肠黏膜绒毛;1为在绒毛中轴出现肠黏膜上皮下的间隙,常常伴随毛细血管充血;2为来自固有膜的肠黏膜上皮抬高以及肠上皮下间隙的扩张;3为大片肠黏膜上皮抬高,绒毛向两侧倒伏,偶有裸露的绒毛尖端;4为裸露的绒毛有外露的固有层和扩张的毛细血管,可看到固有膜细胞成分构成增加;5为固有膜蜕变或被消化,出血或溃疡形成。

1.4免疫组织化学 切取3 μm的切片在60 ℃烘箱烘烤1~2 h,再经过二甲苯(10 min)-二甲苯(10 min)-二甲苯(10 min)-无水酒精(5 min)-90%酒精(5 min)-80%酒精(5 min)-70%酒精(5 min),取出切片用蒸馏水冲洗1 min,置于PBS缓冲液中。柠檬酸钠缓冲液中进行高温抗原修复(100 ℃,20 min),修复后冷却至常温,用PBS洗涤(3 min×3次),滴加内源性过氧化物酶阻断剂,室温孵育10 min,用PBS洗涤,将配制好的一抗滴加在组织上放置于4 ℃过夜,用PBS洗涤(3 min×3次),滴加酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物,37 ℃孵育20 min;用PBS洗涤(3 min×3次),用新鲜配置的DAB室温孵育5 min,自来水冲洗,苏木素染色液孵育20 s;分化、冲洗返蓝;脱水、透明、中性树脂封片,光学显微镜观察(×200),随机选取6个视野并拍照,棕色颗粒即为阳性表达。Image pro-plus软件测定每个视野下的棕色颗粒的光密度(OD)值,计算平均值。

2 结果

2.1大鼠神经评分和体重监测的变化 记录每只大鼠不同天数的体重及神经评分,并绘制成图,造模成功大鼠的神经功能评分维持在较高水平且体重呈下降趋势;治疗组与模型组比较,用药后大鼠神经功能评分降低,神经功能改善且体重下降改善,见图1。

注:Sham为假手术组,MCAO为模型组,PNs为三七总皂苷组 (n=6)。

2.2肠道病理学的变化 通过苏木素和伊红染色后观察肠道病理学变化(放大倍数×100),结果显示,在假手术组中,大鼠小肠绒毛排列整齐,上皮完整。模型组在7 d和14 d的肠道破坏、受损且恢复不佳,用药后大鼠的肠道绒毛数量和形态都有所恢复,见图2。在病理科医生不知情的情况下进行评分,记录每个图片的分值并进行统计学计算,7 d和14 d模型组与假手术组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);治疗组和模型组在7 d和14 d分别进行比较,差异亦具有统计学意义(P<0.05),见表1。

注:Sham为假手术组,MCAO为模型组,

2.3肠道Occludin和ZO-1蛋白表达量的变化情况 对肠道切片进行免疫组织化学,检测紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的蛋白含量,Occludin蛋白主要在黏膜绒毛下连续均匀分布,假手术组Occludin蛋白分布均匀、连续,模型组分布减少,治疗后Occludin蛋白表达增加;ZO-1主要在肠上皮细胞中,假手术组中ZO-1分布均匀,模型组可见ZO-1蛋白表达减弱,分布不均,三七总皂苷治疗后,ZO-1蛋白表达信号增强,见图3。在不同时间点,模型组和假手术组比较,差异具有统计学意义;在不同时间点治疗组和模型组两两比较,差异具有统计学意义,见表2。

表1 不同时间点大鼠肠道HE染色Chiu评分

3 讨论

肠道是人体最大的消化系统,包含消化、代谢调节和免疫等功能[8],同时肠也是创伤后应激的核心器官,在某些严重应激事件(烧伤、中暑、创伤、脑事件和移植等)中,可能会引发一系列肠道事件,包括肠道黏膜破坏、屏障功能障碍、肠道细菌和内毒素移位以及上消化道出血[2]。有实验表明,缺血性中风不仅会改变肠道微生物,还会增加肠道屏障的渗透性[3]。

缺血性脑卒中后,自主神经系统失调降低肠动力,破坏肠黏膜屏障的完整性[9],导致卒中预后不良[10]。同时肠道微生物与肠道屏障密切接触,肠道细菌在肠上皮的黏膜层栖息,当黏膜层破坏时会导致致病菌的入侵,在破坏肠道屏障同时激活肠道淋巴细胞,启动免疫反应,进一步破坏肠道屏障。细菌的代谢物也会对肠道屏障产生影响,当缺血性脑卒中发生后肠道的致病菌增多并伴代谢产物的变化,而细菌代谢产物也参与了中风后肠道屏障的破坏[11]。肠屏障主要分为机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障[12],肠上皮细胞及细胞之间的紧密连接构成肠道的物理屏障。肠道的紧密连接形成蛋白质膜是细胞间连接的一个重要形式,是构成黏膜机械屏障的最重要结构,调节哺乳动物细胞间离子和溶质的扩散。紧密连接包括跨膜蛋白,如Claudin、Occludin和连接黏附分子-A(JAM-A),以及细胞内斑块蛋白,如闭塞带(ZOs)和扣带蛋白[9,13]。Occludin是跨膜蛋白的胞内结构域,与细胞质斑块蛋白相关,为紧密连接提供了结构支架。紧密连接中的支架分子包括ZOs和Cinglin。Occludin和许多Claudin亚型与ZOs(ZO-1,ZO-2,ZO-3)的N端的多结构域结合,而ZO的C端区域与肌动蛋白细胞骨架相互作用,而细胞骨架与紧密连接结构的关联对紧密连接功能的调节和维持至关重要[14]。

注:Sham为假手术组,MCAO为模型组,PNs为三七总皂苷组 (n=6)。

表2 大鼠肠道不同时间段Occludin和ZO-1蛋白的组织免疫化学OD值

紧密连接对于肠道屏障的通透性非常重要,破坏后肠道内外稳态失衡,菌群发生移位,有害物质能够穿透肠壁,由肠道转移至血液中,导致免疫炎性反应激活,释放大量炎性因子,这些炎性因子随血液循环穿过血脑屏障,加重缺血性脑损伤[2,15-16]。本实验发现:缺血性脑卒中后肠道绒毛数量减少、形态破坏,肠道屏障受损,Occludin和ZO-1蛋白的表达量减少,动物神经功能评分增加、体重下降,且肠道屏障受损严重程度和神经评分呈正相关。经三七总皂苷治疗后肠道Occludin和ZO-1蛋白表达有所增加,肠道形态趋于正常,绒毛数量明显增加,提示三七总皂苷治疗缺血性脑卒中作用机制可能与保护肠道功能,维持肠道内外稳态有关,防止有毒有害物质吸收入血,减轻脑缺血后炎症反应,改善症状及神经功能,达到治疗疾病的目的。

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