血清外泌体miR-96表达与老年糖尿病患者骨质疏松的相关性

吴丽明，宋成福，金鹿，杨紫姣

杨浦区中心医院老年科，上海 200090

骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种常见的骨骼疾病，也是糖尿病患者常见并发症之一[1]。研究显示，与正常人群相比，1/2～2/3的糖尿病患者存在骨强度下降现象，同时糖尿病患者发生OP的比率高达50%[2]。糖尿病和骨质疏松是老年人的常发病，随着年龄增长，骨质疏松及跌倒风险增加并导致骨折发生率，不仅影响老年人生活质量，还会增加住院及死亡风险[3]。目前，临床尚缺乏有效的OP治疗方案，且现有治疗方案副作用突出，难以改变病理进程及成骨细胞增殖分化[4]。因此，探究老年糖尿病患者发生骨质疏松的影响因素以及病情进展相关分子机制，对该病早期诊断、临床治疗有重要意义。外泌体(exosomes，EXOs)为直径30～100 nm 的盘状囊泡，内部包裹了miRNA、蛋白等物质，是生物分子在骨重建微环境中发送细胞间信息的载体[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类单链非编码RNA，在转录后参与细胞增殖、分化等过程，并且在生物信号调控网络中扮演重要角色[6]。研究显示，外泌体miRNA参与骨微环境中的骨吸收与骨生成，miRNA异常表达可导致骨质疏松等一系列骨代谢相关疾病[7]。近期有研究发现，miR-96 在老年骨质疏松患者血清、骨髓基质细胞中上调表达，并参与调节骨代谢[8]。此外，研究外泌体中异常表达的miRNA在骨重建中的作用，对理解骨质疏松病理机制及骨质疏松的诊断具有一定临床应用价值。但miR-96 与老年糖尿病合并骨质疏松的关系尚未明确。基于此，本研究通过检测老年糖尿病患者血清外泌体中miR-96 表达，分析其与骨质疏松的相关性，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2019 年1 月至2021年5 月杨浦区中心医院老年科收治的年龄≥60 岁的171例2型糖尿病患者的临床资料，其中男性86例，女性85 例，平均年龄(68.87±6.80)岁。纳入标准：(1)年龄≥60 岁；(2)所有2型糖尿病患者经临床检查均符合《中国2 型糖尿病防治指南(2017 年版)》[9]中相关诊断标准；(3)临床资料完整。排除标准：(1)有服用钙剂、皮质类固醇激素、维生素D等影响骨代谢的药物使用史(3个月内)；(2)合并有嗜铬细胞瘤、胸腺瘤等疾病；(3)合并有糖尿病高渗状态；(4)肝、肺、肾、脑、心等器官损害者；(5)合并有骨髓增生异常综合征等继发性骨代谢异常疾病；(6)合并酮症酸中毒；(7)合并甲状旁腺疾病、甲状腺疾病。基于双能X线法测定骨密度(bone mineral density，BMD)分类标准[10]：T 值=(骨密度测定值-同性别同种族正常成人骨峰值)/正常成人骨密度标准差进行分组，T 值≤-2.5 为骨质疏松(OP 组，82 例)，T 值≥-1.0 或-2.5＜T 值＜-1.0 为正常或低骨量(非OP 组，89 例)。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均为自愿参与本研究，并签署知情同意书。

1.2 观察指标与方法

1.2.1 一般资料收集及骨代谢检测 收集入组者的年龄、性别、病程、体质指数(BMI，kg/m2)、超敏-C反应蛋白(hs-CRP)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、糖化血红蛋白(HbAlc)、总胆固醇(CHOL)、空腹C 肽、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)等指标。所有受试者均于早上空腹抽取肘静脉血，并在离心机上以3 000 r/min转速离心5 min，随后分离血清，-80℃冷冻箱贮存备用。采用酶联免疫法检测血清25-羟维生素D3[25(OH)D3]、I 型胶原羧基端肽交联(β-CTX)、甲状旁腺激素(PTH)、骨钙素(BGP)、I型前胶原氨基末端前肽(PINP)水平。25(OH)D3(批号：H995860)、β-CTX(批号：E-EL-H0835)检测试剂盒由上海玉博生物科技有限公司提供，PTH(批号：H207)、PINP(批号：H285)、BGP(批号：H152)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，检测仪器为全自动生化分析仪(型号：BS-800，迈瑞医疗)，严格按照说明书操作。

1.2.2 骨密度检测 双能X 线骨密度检测仪(型号：Dexa Pro-l，徐州品源医疗科技有限公司)测定患者的双侧髋部(粗隆间、大转子、股骨颈)骨密度及正位腰椎(L1～4)骨密度。

1.2.3 提取血清外泌体 所有受试者均于早上空腹抽取肘静脉血，离心后收集上层血清，使用外泌体提取试剂盒(批号：BB-39022，贝博生物)提取血清外泌体，提取后用于下一步的RNA提取及酶联免疫吸附试验。

1.2.4 外泌体中miR-96 表达水平检测 使用Trizol 法(批号：15596-026，Life Technologies，美国)裂解血清外泌体，硅胶膜吸附柱过滤纯化，超微量核酸蛋白分析仪(型号：MD2000D，Biofuture，英国)检测RNA 质量与浓度，然后取1µg RNA 按照反转录试剂盒(批号：MR101-01，Vazyme，中国)步骤进行反转录，使用SYBR Green 染料(批号：MQ101-01，Vazyme，中国)在LightCycler 480 仪器定量仪(Roche Diagnostics，瑞士)上进行PCR 反应，反应程序为：95℃5 min；95℃10 s、60℃30 s，重复2、3 步骤40个循环。引物序列如下：miR-96 (F：CAUCUGAAUAGACGATTAG-3'，R：GAUAGCACUAGCCGC)，U6 (F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3')，由上海生工生物公司合成。以U6 为内参，利用2-△△Ct法计算血清外泌体中miR-96相对表达量。

1.3 统计学方法 应用SPSS21.0 软件进行数据统计学分析。计数资料以例(%)比较，采用χ2检验；符合正态分布的计量资料以均值±标准差(±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验；采用Pearson 相关分析法分析miR-96与BMI、BGP、25(OH)D3、β-CTX、PTH、HbA1c、PINP 的相关性。多因素Logistic 回归分析影响老年糖尿病患者发生骨质疏松的相关因素。受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristics，ROC)分析血清外泌体miR-96对老年糖尿病患者并发骨质疏松的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的临床资料比较 非OP 组与OP组的BMI、β-CTX、25(OH)D3、HbAlc、PTH、BGP、PINP比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；非OP 组与OP 组的性别比例、病程、年龄、Hs-CRP、TG、HDL-C、CHOL、LDL-C及空腹C肽比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 两组患者的临床资料比较[±s，例(%)]Table 1 Comparison of clinical data of two groups of patients [±s，n(%)]

表1 两组患者的临床资料比较[±s，例(%)]Table 1 Comparison of clinical data of two groups of patients [±s，n(%)]

项目男/女年龄(岁)BMI(kg/m2)病程(年)Hs-CRP(mg/L)HbAlc(%)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)CHOL(mmol/L)空腹C肽(ng/mL)β-CTX(ng/L)BGP(ng/mL)PINP(ng/L)PTH(pg/mL)25(OH)D3 (ng/mL)非OP组(n=89)47(52.81)/42(47.19)68.30±4.52 24.53±3.94 9.47±7.06 3.79±1.02 7.96±1.13 1.49±0.32 1.27±0.26 2.96±0.45 4.83±1.04 1.24±0.25 9.25±2.31 15.91±2.87 42.39±5.26 41.58±6.94 17.62±3.43 OP组(n=82)39(47.56)/43(52.44)69.48±5.10 23.17±3.68 9.84±6.78 4.05±1.17 8.32±1.04 1.56±0.37 1.19±0.31 3.04±0.41 4.91±1.09 1.30±0.27 14.68±3.06 8.60±2.04 47.12±6.19 48.74±7.60 12.45±1.82 χ2/t值0.470 1.604 2.327 0.349 1.552 2.162 1.326 1.833 1.212 0.491 1.509 13.160 19.051 5.398 6.439 12.161 P值0.493 0.111 0.021 0.728 0.123 0.032 0.187 0.069 0.227 0.624 0.133 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 两组患者的血清外泌体miR-96表达水平比较 OP 组患者血清外泌体miR-96 表达水平为1.42±0.31)，明显高于非OP组的1.01±0.25，差异有统计学意义(t=9.554，P＜0.05)。

2.3 血清外泌体miR-96与各变量的相关性 经Pearson 相关分析结果显示，血清外泌体miR-96 与BMI、BGP、25(OH)D3呈 负 相 关，与β-CTX、PTH、HbA1c、PINP呈正相关(P＜0.05)，见表2。

表2 血清外泌体miR-96与各变量的相关性Table 2 Correlation between serum exosome miR-96 and various variables

2.4 影响老年糖尿病患者并发骨质疏松的相关因素 将单因素分析中差异有统计学意义的BMI、HbA1c、25(OH)D3、PTH、β-CTX、BGP、PINP 以 及miR-96为自变量，以老年糖尿病患者发生骨质疏松为因变量(骨质疏松=1，正常或低骨量=0)，纳入多因素Logistic 回归分析，采用逐步后退法，结果显示，miR-96、β-CTX、BGP、BMI、25(OH)D3、HbA1c、PINP、PTH 均是老年糖尿病患者发生骨质疏松的相关影响因素(P＜0.05)，见表3。

表3 影响老年糖尿病患者并发骨质疏松的相关因素的多因素Logistic回归分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of the related factors affecting osteoporosis in elderly patients with diabetes

2.5 血清外泌体miR-96表达水平诊断骨质疏松的效能 经ROC 分析结果显示，血清外泌体中miR-96 诊断老年糖尿病患者并发骨质疏松的曲线下面积为0.878(95%CI：0.828～0.927)，取截断值为1.22，该值对应的敏感度和特异度分别为84.30%、75.60%，见图1。

图1 血清外泌体miR-96表达水平诊断骨质疏松的ROCFigure 1 ROC of serum exosome miR-96 expression in the diagnosis of osteoporosis

3 讨论

2型糖尿病是一种常见的慢性代谢疾病，据统计，仅在2019 年，因该病死亡的人数就超过150 万人，然而随着现代生活方式、饮食结构等不断改变，2型糖尿病发病率仍在持续增加[11]。骨质疏松是糖尿病患者一种常见的并发症，糖尿病患者若发生骨质疏松，不仅增加临床治疗难度，还会增加病理性骨折风险，严重影响患者生活质量[12]。然而，糖尿病患者发生骨质疏松的具体病理机制尚不清楚，可能与机体长期处于胰岛素抵抗状态、高血糖状态、糖脂代谢、晚期糖基化产物的累积、骨代谢等因素的共同作用有关[13]。因此，急需解析糖尿病患者发生骨质疏松的分子机制，以期为临床治疗提供参考。

外泌体是细胞分泌的一种细胞外囊泡，参与发育、衰老、代谢调节、压力、运动等一系列正常生理过程。据报道，由成骨细胞、骨细胞、内皮细胞、破骨细胞、间充质干细胞细胞释放的外泌体与骨重建过程密切相关，且具有高稳定性、无免疫原性及靶向能力强等特点[5]。众所周知，外泌体中含有多种生物活性成分，如miRNA、mRNA、蛋白质等，并参与蛋白及核酸运输、免疫应答等生理过程[14]。其中，外泌体中丰富的miRNA也参与骨骼代谢过程。例如，骨髓间充质干细胞(BMSCs)分泌的外泌体能够促进成骨细胞增殖，而细胞中的miR-935 能够靶向并负调控信号转导和转录激活因子1 表达促进成骨细胞增殖及分化[15]；在骨质疏松患者中，来源于BMSCs 的外泌体通过上调miR-424-5p表达水平，抑制成骨细胞分化[16]。值得关注的是，外泌体可保护循环miRNA免受RNA酶降解，且外泌体中miRNA 检测简便，可得到客观数据，故而血清外泌体miRNA 成为一种新型疾病早期诊断标志物，具有临床推广性[8]。

既往研究显示，miR-96在肺癌、肝癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤中上调表达，发挥促癌基因功能[17]。近期，研究发现miR-96 参与骨代谢过程，例如Liu 等[8]研究发现，miR-96 在老年骨质疏松患者血清以及BMSCs中上调表达，miR-96通过靶向抑制osterix参与成骨分化。另有研究显示，miR-96的过表达通过激活Wnt信号通路，促进强直性脊柱炎小鼠的成骨细胞分化和骨形成[18]。本研究中，老年糖尿病合并骨质疏松患者的血清外泌体miR-96 表达水平显著高于非骨质疏松者，与既往研究相似，说明miR-96 表达与老年糖尿病患者发生骨质疏松有关，参与骨质疏松的发生、发展。本研究多因素Logistic 回归显示，miR-96 是影响老年糖尿病骨质疏松的影响因素，提示监测血清外泌体miR-96 表达变化能够反映老年糖尿病患者是否合并骨质疏松，miR-96 有作为临床血清诊断标志物潜能。吴冠瑾等[19]研究显示，卒中后认知功能障碍(PSCI)患者外周血miR-96表达水平升高，并通过绘制ROC 曲线发现miR-96 诊断PSCI 的曲线下面积为0.877，说明miR-96 对PSCI 有较好的诊断价值。结合本研究结果推测miR-96 在辅助诊断骨质疏松方面也有一定作用。经ROC 分析显示，血清外泌体miR-96诊断老年糖尿病患者并发骨质疏松的曲线下面积为0.878，截断值为1.22，敏感度为84.30%，特异度为75.60%，提示miR-96 可用于辅助临床对老年糖尿病合并骨质疏松的诊断。

骨代谢标志物是评估机体成骨、破骨活性的重要指标[12]。本研究中使用β-CTX、BGP、PINP、25(OH)D3、PTH 反映骨代谢情况，其中β-CTX、PINP 属于骨吸收的标志物，BGP 由成骨细胞产生，能够激活成骨细胞并且参与调节骨吸收[20]。25(OH)D3能够调节骨代谢及钙磷代谢过程，促进骨骼生长。此外，PTH 不仅能够促进破骨细胞的骨吸收，还参与调节钙、磷代谢过程。本研究通过Pearson相关性分析发现，血清外泌体miR-96 表达水平与骨代谢指标β-CTX、BGP、PINP、25(OH)D3、PTH 以及基线资料BMI、HbA1c 均具有明显相关性。既往研究显示低BMI 会增加骨质疏松风险，而高HbAlc水平会影响骨重建功能，易于诱发骨质疏松[21]。以上结果表明血清外泌体miR-96 与老年糖尿病合并骨质疏松密切相关，miR-96在评估患者骨吸收等活动中具有一定作用，进一步证实通过监测血清外泌体miR-96 水平可及时动态了解老年糖尿病患者的骨代谢情况。

综上所述，老年糖尿病并发骨质疏松患者的血清外泌体miR-96 表达水平升高，miR-96 表达变化与骨代谢指标具有明显相关性，且与骨质疏松发生有关，miR-96 可用于临床辅助诊断糖尿病患者并发骨质疏松。但本研究仍存在局限性，如纳入病例数较少，miR-96参与骨质疏松的具体调控机制尚未明确，仍需后续开展更高质量的研究加以证实。