茶树CsPHT1;3基因特性及其对硒的响应研究

郭丽娜，郝心愿，王璐，祁蒙，李晓嫚，任恒泽，郑青华，王新超，曾建明*

茶树基因特性及其对硒的响应研究

郭丽娜1,2，郝心愿2，王璐2，祁蒙1，李晓嫚2，任恒泽2，郑青华2，王新超2，曾建明1,2*

1. 安康市富硒产品研发中心，陕西 安康 726000；2. 中国农业科学院茶叶研究所/农业农村部茶树生物学与资源利用特种经济动植物生物学与遗传育种重点实验室，浙江 杭州 310008

茶树具有较强的富硒能力，有关磷酸盐转运体参与硒吸收的分子机理研究较少。克隆茶树基因，并探究该基因的特性及对硒浓度和价态、pH、时间的响应，以及在不同聚硒茶树品系中的表达情况。基因特性分析表明，属于磷酸盐转运蛋白PHT1亚家族成员，定位于质膜且具有PHT1蛋白保守结构域GGDYPLSATIxSE。在不同器官中表达模式分析表明，在成熟叶和根中表达量显著高于其他器官。不同浓度和价态硒诱导结果表明，在茶树根系中于1 d和7 d显著受低浓度Se4+诱导表达；除处理后3 d外，茶树根系中显著受Se6+诱导上调表达且基本不受Se6+浓度影响。不同pH处理茶树结果表明，茶树根系中在pH=5时对Se4+响应于24 h达最高；在pH=3时对Se4+响应于48 h达最高；而在pH=7时，对Se4+响应于72 h达最高。硒酸钠处理不同聚硒茶树品系结果表明，在不同品系的叶和根中的表达均不响应硒酸钠处理；而亚硒酸钠处理不同聚硒茶树品系结果表明，在高聚硒品种叶中显著上调表达。以上研究结果表明，可能参与茶树根系对亚硒酸盐的吸收和再分配，其对富硒茶树品系的选育具有重要意义。

茶树；硒吸收；亚硒酸盐；硒；pH

硒是人体必需的微量元素，适量摄入硒有益于人体健康，而缺硒或过量摄入硒则会引起一些疾病[1]。在植物体内，适量的硒具有提高植物抗氧化作用，有利于植物的生长，而过量的硒会导致植物受到毒害，这可能由于硒参与植物细胞体内的氧化应激反应或硒代氨基酸非特异性结合到蛋白质中影响蛋白质的折叠和功能[2]。富硒植物作为人体重要补硒来源之一，主要利用根系从土壤中吸收硒元素。在我国，土壤中的硒资源分布极不均匀，有51%的土壤处于缺硒状态[3]，而在缺硒地区生活的人们仅依靠食物补硒无法满足人体对于硒的需求。茶树具有较强的富硒能力，茶叶中硒主要以有益于人体健康的有机硒形态存在[4]。因此，通过合理的开发富硒茶树品种对人们补充硒元素具有重要意义。

植物根部组织主要摄取以SeO32-和SeO42-形态为主的硒元素。硒元素在碱性土壤中主要以硒酸盐形态存在，而在酸性土壤中主要以亚硒酸盐形态存在。植物根系主要利用硫酸盐转运体吸收硒酸盐[5-6]；而植物对于亚硒酸盐的吸收机制尚不清楚。Shrift等[7]研究发现，亚硒酸盐主要通过被动扩散的方式进入植物体内，而Broyer等[8]研究发现磷酸盐浓度的增加会抑制植物根系对亚硒酸盐的吸收。水稻PHT1家族成员相关研究表明，OsPHT1;2和OsPHT1;8磷酸盐转运蛋白均参与根系对磷酸盐和亚硒酸盐的吸收和转运[9-10]，和在维持根系中磷酸盐浓度平衡时功能冗余[11]。然而目前关于参与植物根系吸收和转运亚硒酸盐的相关研究较少。

亚硒酸盐是茶树根系主要吸收的无机盐形式之一。其中，亚硒酸盐被吸收后大部分累积于根部组织，而少部分转运并积累在叶片中[12]。Cao等[13]研究发现，茶树中PHT1家族成员主要与根部亚硒酸盐的吸收或者转运相关，其中在茶树根和茎中高表达，且在根部组织的表达量随亚硒酸钠处理浓度的升高显著降低。辛华洪[14]研究了茶树中的PHT1家族同源基因和在不同器官中表达以及对磷胁迫的响应，并验证体外转运磷的功能。Ren等[12]利用茶树根部组织的转录组与蛋白组联合分析发现，在亚硒酸钠处理后表达量显著上调。而关于基因特性以及对硒的响应研究鲜有报道。

本研究主要对基因特性进行分析，并探究基因在不同浓度硒、价态硒、pH、时间以及不同茶树聚硒能力条件下的响应模式，旨在为今后开展磷酸盐转运家族基因参与亚硒酸钠吸收和转运研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以中国农业科学院茶叶研究所（浙江杭州）试验基地的中茶108茶树品种，以及经过2019—2022年在杭州、恩施两地3年重复选育的高（CT2009-0028、中茶硒茶4号、硒茶1号）、低（CT2009-0025）聚硒品系为试验材料。取种植于试验基地的中茶108的芽、一叶、二叶、三叶、成熟叶、茎和根部组织样本，立即置于液氮中速冻，保存在–80 ℃超低温冰箱中备用。

硒酸钠（Na2SeO4）和亚硒酸钠（Na2SeO3）分别购自于山东西亚化学工业有限公司和Sigma有限公司，茶树木本植物营养液购自于北京酷来博科技有限公司。

1.2 试验处理

1.2.1 不同浓度硒酸钠和亚硒酸钠处理

选取长势一致的一年生中茶108茶树，于pH 5.0的1/4营养液中培养，营养液的配方参照文献[15]，于22 ℃、光照12 h，全天通气条件下培养。每隔1周更换1次营养液，待茶苗长出新根，置于空白对照及分别含Na2SeO4（0.6、3 mg·kg-1）和Na2SeO3（0.6、3 mg·kg-1）的1/4茶树木本植物营养液中处理，分别于1、3、5 d和7 d取根部组织，立即放于液氮中，保存于–80 ℃超低温冰箱中备用，每个处理设置4个生物学重复。

1.2.2 不同培养时间和pH处理

选取长势一致的一年生中茶108，其培养方式同1.2.1章节，将长出新根且长势健康一致的中茶108植株置于空白对照及分别含Na2SeO4（5 μmol·L-1）和Na2SeO3（5 μmol·L-1）的1/4茶树木本植物营养液中培养，分别调节pH至3、5和7，分别在24、48、72 h取根部组织，立即放于液氮中，保存于–80℃超低温冰箱中备用，每个处理设置4个生物学重复。

1.2.3 不同价态硒对不同茶树品系的处理

选取长势一致的一年生CT2009-0028、中茶硒茶4号、硒茶1号和CT2009-0025，其培养方式同1.2.1章节，将长出新根的不同高低聚硒茶树品种置于空白对照及分别含5 μmol·L-1Na2SeO4和5 μmol·L-1Na2SeO3的溶液中，14 d后，分别取成熟叶和根部组织，立即放于液氮中，保存于–80 ℃超低温冰箱中备用，每个处理设置4个生物学重复。

1.3 CsPHT1;3的生物信息学分析

基于茶树基因组数据和硒响应的转录组数据库[12,16]筛选出PHT1;3的同源序列。通过ORF Finder（http://www.bioinformatics.org/ sms2/ orf_find.html）查找基因的开放阅读框信息，并使用NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BlastX和BlastN分别对其氨基酸序列和核酸序列查找同源序列。利用MEGA7.0软件，采用邻接法（NJ）设置Bootstrap值为1 000，构建关于PHT1家族的系统发育树。使用MEME网站（https://meme-suite. org/meme/tools/meme）构建PHT1家族的蛋白保守结构域，使用TBtools软件将进化树和蛋白保守结构域整合作图。利用ExPASy软件（https://web.expasy.org/protparam）预测的分子量和等电点信息。

1.4 CsPHT1;3的克隆

依据开放阅读框序列，利用Primer 5.0设计特异引物，引物序列如表1所示。采用PrimeSTAR HS DNA聚合酶[宝生物工程（大连）有限公司]和RT-PCR体系扩增基因全长序列，PCR扩增程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.5 CsPHT1;3的亚细胞定位

通过基因的ORF序列和pBWA(V)HS载体序列设计含酶切位点且去除原基因终止密码子的引物序列（表1）。利用双酶切酶连反应，将基因与含N端35 S-eGFP的pBWA(V)HS载体相连接。提取水稻原生质体，利用聚乙二醇4000（PEG4000）介导将融合表达载体质粒转入水稻原生质体，通过激光扫描共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果[17]。

表1 试验所用引物

1.6 CsPHT1;3的qRT-PCR分析

1.7 数据分析

所有数据均用4次独立测量数据的平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 8.0软件进行图形绘制。使用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，检验进行各组间的统计学差异分析。

2 结果与分析

2.1 CsPHT1;3的克隆和生物信息学分析

基于开放阅读框信息，以中茶108根组织的cDNA为模板，利用特异性引物克隆获得。（Genbank No. OP219455）的开放阅读框包含1 620个碱基，编码539个氨基酸，预测蛋白分子量为59.1 kDa，等电点为8.62。

为明确茶树基因与其他物种基因之间的进化关系及序列特征，利用氨基酸序列构建进化树和蛋白保守结构域（图1A）。进化树分析结果表明，属于PHT1家族，与巴坦杏、大豆、拟南芥和水稻的亲缘关系更近，而与拟南芥的和以及水稻的和亲缘关系较远。预测结果表明，包含12个保守结构域，且每个基因的保守结构域数量在4～12个，除了只包含4个基序，其他基因均含有基序1～基序7和基序9。将在NCBI中进行BlastP同源比对，结果表明，CsPHT1;3磷酸转运蛋白的氨基酸序列与巴坦杏（，XP_034228833.1）PdPHT1;3的相似度最高，达79%；与大豆（，ACY74614.1）GmPHT1;3、拟南芥（，AT5G 43360.17）AtPHT1;3相似度分别为78%和77%。CsPHT1;3与其他物种中的PHT家族相似，均具有预测的12个跨膜固定结构域。利用DNAMAN多序列比对分析发现，CsPHT1;3中也鉴定出了Pht1的保守结构域GGDYPLSATIxSE（图1B）。

2.2 CsPHT1;3的组织特异性及亚细胞定位

由图2可知，随叶片成熟度的增加，表达量显著增加；在成熟叶和根中高表达且极显著高于其他器官。

注：A，不同物种中的PHTs氨基酸序列构建进化树；线性代表进化距离，CsPHT1;3用圆圈表示(●)。B，阴影表示相同氨基酸，点表示间隙，划线标示Pht1的特征序列，虚线表示12个跨膜结构域

将重组质粒pBWA(V)HS-CsPHT1;3-GLosgfp与细胞膜marker共转入水稻原生质体，24 h后在激光共聚焦显微镜下进行观察。CsPHT1;3蛋白亚细胞定位结果表明（图3），CsPH1;3-GFP融合蛋白在水稻原生质体中定位于细胞膜中。

注：误差线表示4个生物学重复的标准偏差，不同小写字母代表在0.05水平上差异显著

注：A1、B1、C1、D1为阳性对照，只含有35 S启动子和绿色荧光蛋白（GFP）；A2、B2、C2、D2为CsPHT1;3蛋白的亚细胞定位

2.3 CsPHT1;3对不同浓度和价态硒的响应

不同浓度硒和价态硒对诱导表达结果表明，与对照相比，除3 d外，0.6 mg·kg-1和3 mg·kg-1硒酸钠处理均极显著诱导的上调表达，表达量在5 d时最高。0.6 mg·kg-1和3 mg·kg-1亚硒酸钠处理茶树时，表达量均于5 d达到最高，除3 d外，其余时间点均表现出低浓度的亚硒酸钠处理更有利于上调表达，而高浓度亚硒酸钠处理7 d时，显著诱导下调表达（图4）。

2.4 CsPHT1;3对不同pH、时间以及不同价态硒的响应

不同pH、时间以及不同价态硒处理茶树时，在茶树根系中的表达情况如图5所示，在pH=3时，受硒酸钠与亚硒酸钠的诱导均于48 h达到最高；在pH=5时，于24 h时显著受亚硒酸钠的诱导且高于硒酸钠，随处理时间的增加，亚硒酸钠对诱导表达减弱，而硒酸钠对诱导表达增强，且在72 h时，硒酸钠对基因的诱导显著高于亚硒酸钠；在pH=7时，亚硒酸钠对的诱导随处理时间的增加而增强，且在72 h时达到最高，上调水平约为对照的7倍。

注：误差线表示4个生物学重复的标准偏差，*代表在0.05水平上差异显著，**代表在0.01水平上差异极显著

注：误差线表示4个生物学重复的标准偏差，*代表在0.05水平上差异显著，**代表在0.01水平上差异极显著

2.5 不同聚硒能力茶树品系中CsPHT1;3对硒的响应

以高低聚硒茶树品系为研究对象，分别进行5 μmol·L-1的Na2SeO4和Na2SeO3处理，成熟叶和根中的定量结果如图6所示。Na2SeO4处理茶树时，各品种成熟叶和根中的表达量均无显著变化；而Na2SeO3处理茶树时，在3个高聚硒品种成熟叶中的表达量均显著上调，且在硒茶1号高聚硒品种根中的表达量也显著上调。

3 讨论

在磷酸盐转运蛋白中，研究最广泛的是PHT1亚家族成员。随着拟南芥、水稻和茶树植物全基因组分析的完成，通过比较基因组方法鉴定出更多具有同源性的PHT1亚家族成员，目前在拟南芥、水稻和茶树中分别鉴定出9个、13个[19]和9个基因[13]。水稻和拟南芥中的PHT1亚家族成员均编码H+/Pi共转运体，具有高度序列相似度且包含12个可预测跨膜结构域[20]，主要定位于质膜上，这与研究结果相一致。基因功能一般与蛋白定位以及基因表达模式密切相关[21]。本研究发现，CsPHT1;3蛋白定位于质膜上且在茶树的芽、叶、茎、根等器官中均有表达，尤其在成熟叶和根中表达量较高。因此，推测可能参与元素的吸收和再分配。

硒酸盐和亚硒酸盐是土壤中硒主要存在的无机形态，也是植物硒吸收的主要来源。土壤中硒的赋存形态易受pH值等因素的影响[22]。在酸性土壤中，亚硒酸钠主要以HSeO3-形式存在，而在碱性土壤中，主要以SeO32-形式存在[23]。茶树适宜生长于pH为4.5～6.5的土壤中，主要吸收亚硒酸盐[15]。本研究发现，pH能够显著诱导的表达。相比较于pH=7处理，茶树根系中的表达更易受pH=5和pH=3处理的短时诱导。硒浓度也是影响硒赋存形态的主要因素之一，低浓度亚硒酸盐主要以H2SeO3、HSeO3-和SeO32-形式存在，而高浓度亚硒酸盐可能主要以(H2SeO3)2、H(HSeO3)2-和(HSeO3)22-的复杂形式存在[24]。其中，HSeO3-是由磷酸盐转运体吸收和转运进入植物根系。Cao等[13]研究发现，在茶树根中响应低浓度亚硒酸盐处理。本研究发现，在适宜pH条件下（pH=5），在处理1 d和7 d时显著受低浓度亚硒酸钠诱导。以上研究结果表明，茶树根系中的表达受pH和硒浓度的诱导，可能在参与吸收亚硒酸盐的过程中发挥重要作用。

注：误差线表示4个生物学重复的标准偏差，**代表在0.01水平上差异极显著

富硒植物与非富硒植物对硒的富集存在显著差异。研究发现，硫酸盐转运体基因的表达和序列差异可能是引起高低聚硒的一个内在关键基因。硒酸钠处理黄芪时，富硒黄芪根系中的表达量高于在非富硒黄芪根系中的表达量[25]。在亚硒酸盐处理时，和在富硒沙漠王羽地上组织中的表达量高于非聚硒白花槐地上组织[26]。目前，磷酸盐转运体基因在不同聚硒植物中的研究较少，主要集中于对亚硒酸盐的吸收和转运功能研究。在水稻中，过表达基因显著受亚硒酸钠的诱导且亚硒酸钠处理会增加水稻根系对硒的吸收速率和累积量[9]。茶树转录组分析发现，茶树根系中磷酸盐转运体基因响应亚硒酸钠的处理[12-13]。在本研究中，亚硒酸钠处理茶树时，在富硒茶树品系叶片中的表达量高于在非富硒茶树叶片中的表达量。此研究结果表明，可能参与叶片中硒元素的再分配。为进一步验证的功能，今后需要开展的植物转基因功能验证。同时，为深入研究富硒和非富硒茶树的基因调控网络，需要开展更多关于富硒和非富硒茶树品系的有关基因研究，以期更加明确硒酸盐和亚硒酸盐吸收和转运的分子机制。

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Study on the Characteristics ofand Its Response to Selenium in Tea Plants

GUO Lina1,2, HAO Xinyuan2, WANG Lu2, QI Meng1, LI Xiaoman2, REN Hengze2, ZHENG Qinghua2, WANG Xinchao2, ZENG Jianming1,2*

1. Ankang Research Center of Se-enriched Product, Ankang 726000, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization Special Economic Animal and Plant Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

Selenium(Se) is an essential microelement for human, and Seenriched products are important sources for Se intakein human. Tea plants () have strong selenium enrichment ability.However, there is limited research on the molecular mechanism of phosphate transporters involved in Se absorption. In this study,gene was cloned and its characteristics and responses to Se concentrations, valence, pH, time and expression in various Se-enriched tea resources were investigated. Gene characteristicanalysis ofshows thatis grouped into phosphate transporter PHT1 subfamily and localized in the plasma membrane. ThePHT1;3 protein contains the conserved domain GGDYPLSATIxSE, which belongs to the PHT1 protein. Expression pattern analysis ofs that the expression levels ofs and valence states indicate that;was significantly induced by Se4+at 1 d and 7 dafter treatments. The expression ofCsPHT1;3 in roots was obviously induced by Se except for 3 d after treatment but largely unaffected by Se6+concentration. The results of different pH and Se4+treatments show that, at pH5, the highest expression ofin tea roots was observed at 24 h. While at pH3, the highest expression ofwas observed at 48 h. Moreover, at pH7, the highest expression ofThe results of sodium selenate treatment on different Se-enriched tea resources indicate that the expression ofdid not respond to sodium selenate treatment. However, the results of sodium selenite treatment on different Se-enriched tea resources suggest thatis significantly up-regulated in the leaves of Se-enriched tea resources. The above studies indicated thatmay participate in the absorption and redistribution of selenite by roots in tea plants, which is important for the breeding of Se-enriched tea cultivars.

tea plants, Se intake, selenite, selenium, pH

S517.1；Q786

A

1000-369X（2023）02-173-10

2022-11-01

2023-02-27

中国农业科学院科技创新工程协同任务（CAAS-XTCX20190025-7）、中国富硒产业研究院富硒专项“236”计划项目（2019QCY-1.2）

郭丽娜，女，硕士研究生，主要从事茶树育种、种植方面的研究。*通信作者：zengjm@tricaas.com