GC-MS分析艾纳香叶超临界提取物中的挥发性成分

王国盼,杨 达,陆安静,秦 琳,张倩茹,王建梅,杨再文,何 莉,谭道鹏

(1.遵义医科大学 贵州金钗石斛产业发展关键技术工程中心,贵州 遵义 563000;2.贵州汇腾科技有限公司,贵州 遵义 563000;3.贵州苗药生物技术有限公司,贵州 铜仁 554400)

艾纳香,又名大风艾、大毛药、大艾等,为菊科艾纳香属植物艾纳香[Blumeabalsamifera(L.)DC.]的叶及嫩枝[1],是一种传统苗药,其性味辛、微苦、微温,具有祛风除湿、温中止泻、活血散瘀之功效,可用于风湿痹痛、跌扑伤痛,可治疗胃溃疡[2]、促进皮肤创伤及烧伤愈合等[3-4]。艾纳香广泛分布于贵州、广东、海南、云南、广西、福建等长江以南省区,特别是在贵州省的罗甸县具有规模化的种植[5]。化学成分研究表明,艾纳香含有挥发油、黄酮类、倍半萜类、苯丙素类等多种类型的化学成分[6]。其中,艾纳香挥发油有特殊的清香气,具有抗菌、消炎、止痛、抗氧化、驱虫等多种活性[7-8],用于治疗风湿性关节炎、湿疹、产后痛风等[9],被认为是艾纳香的主要有效成分,是咽立爽口含滴丸[10]、金喉健喷雾剂[11]等多种贵州特色民族药复方制剂的活性组分之一。此外,因具有显著的抗菌、抗氧化活性,艾纳香挥发油还被日益广泛的应用于日化品行业[12]。文献报道艾纳香挥发性成分主要包括L-龙脑、樟脑、2-茨醇、β-石竹烯、桉叶油醇、古芸烯、芳樟醇、松油醇、丁子香酚、愈创木醇、库贝醇、花椒油素等[13-15],其中L-龙脑为艾片的主要有效成分,具有显著的消炎止痛、抗菌、抗氧化、抗病毒等多种生物活性[16],花椒油素具有抑制血小板凝聚的作用[17],L-龙脑、樟脑均具有较好的抗脑缺血再灌注损伤作用[18-19],β-石竹烯具有抑菌、抗炎、抗抑郁等作用[20]。此外,还发现艾纳香挥发油中的其他成分如芳樟醇、葎草烯、α-古芸烯、石竹烯氧化物、δ-杜松烯等都表现出较好的抑菌活性[21]。

挥发油的传统提取方法主要采用水蒸气蒸馏法,但该方法具有高耗能、有效成分得率较低等缺点。CO2超临界提取是一种新型的提取技术,具有有效防止热敏性物质破坏、提取效率高且能耗较少,操作简单、自动化程度高、各项指标易于准确控制[22]等优点,日益广泛地应用于食用油或中药挥发油的提取,如薄荷精油[23]、花椒精油[24]、艾叶挥发油[25]等。

近年来,关于艾纳香挥发油的提取报道,有水蒸气蒸馏法[26]、同时蒸馏萃取法[27]、顶空固相微萃取法[28]、微波辅助法[29]等。本研究采用CO2超临界萃取技术提取艾纳香叶中的挥发性成分,并采用GC-MS技术分析鉴定其化学成分,以期为艾纳香的进一步合理开发及综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 多功能粉碎机(BO-100P2,永康市铂欧五金制品有限公司),万分之一天平(ME203E/02,上海梅特勒-托利多仪器有限公司),超临界CO2萃取仪(RZSCF230-50-5+1L,南通睿智超临界科技有限公司),GC-MS联用仪(GCMS-TQ8040,日本岛津公司)。

1.1.2 试剂 C7-C40系列正构烷烃标准液(坛墨质检科技股份有限公司)、正己烷[AR,萨恩化学技术(上海)有限公司]、丙酮[AR,重庆川东化工(集团)有限公司]、无水硫酸钠(AR,国药集团化学试剂有限公司)。

1.1.3 药材 艾纳香叶(产地:贵州省罗甸县,批号:20181001)由贵州苗药生物技术有限公司提供,经遵义医科大学谭道鹏副教授鉴定为菊科植物艾纳香Blumeabalsamifera的干燥叶。

1.2 方法

1.2.1 艾纳香叶CO2超临界提取物的制备 取干燥的艾纳香叶,粉碎,称取455 g,装入CO2超临界萃取仪的萃取釜中,设置压力30 MPa、温度46～47 ℃,用超临界CO2循环萃取80 min,然后从分离釜(I分压力:7 MPa;Ⅰ分温度:41～42 ℃;Ⅱ分压力:6 MPa;Ⅱ分温度:44～45 ℃)中分离出艾纳香叶CO2超临界提取物。

1.2.2 艾纳香叶CO2超临界提取物的GC-MS分析 取艾纳香叶CO2超临界提取物适量,加入10 mL正己烷充分溶解,用无水硫酸钠除水,稀释至适宜浓度后用0.22 μm微孔滤膜过滤并进行GC-MS分析。气相色谱条件:色谱柱为SH-Rxi-5Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱;程序升温条件:柱温70 ℃(保持2 min),以5 ℃/min升温至150 ℃(保持2 min),以10 ℃/min升温至260 ℃保持10 min至完成分析。进样口温度250 ℃,载气为高纯氦气,载气流量1.0 mL/min,进样量0.5 μL,分流比10∶1;质谱条件:离子源为EI源,离子源温度200 ℃,接口温度250 ℃,电子能量70 eV,溶剂延迟1.5 min,质量范围为45～500 amu。采用NIST标准质谱数据库检索并结合保留指数进行定性分析,仅报道匹配度大于80%(最大值100%)的鉴定结果,采用峰面积归一化法定量。

1.2.3 保留指数的测定 精密吸取C7-C40系列正构烷烃标准液100 μL,加正己烷定容至1 mL,摇匀,0.22 μm微孔滤膜过滤后即得0.1 mg/mL C7-C40正构烷烃混标溶液。按照1.2.2中的色谱条件分析正构烷烃混标,记录保留时间。各组分的保留指数根据其保留时间与C7-C40正构烷烃混标的保留时间通过GC-MS-TQ8040联用仪的数据分析软件(GC-MS再解析)自动计算求得。

2 结果

2.1 GC-MS联用技术分析艾纳香叶CO2超临界提取物中的挥发性成分 采用CO2超临界萃取技术提取得到的艾纳香叶提取物为黄绿色油状物,得率为9.01%。采用GC-MS联用技术对艾纳香叶CO2超临界提取物中的挥发性成分进行分析鉴定,共分离出119个组分。各组分的质谱数据经计算机检索NIST标准质谱数据库并结合保留指数定性分析,采用峰面积归一化法测定各组分的相对含量,共鉴定78种化合物,占艾纳香叶挥发性成分总量的87.02%(表1)。图1为艾纳香叶和C7-C40系列正构烷烃标准液的GC-MS总离子流色谱。

表1 艾纳香叶CO2超临界提取物中化学成分组成

续表1

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A:艾纳香叶CO2超临界提取物;B:C7-C40系列正构烷烃标准液。图1 GC-MS总离子流色谱

2.2 艾纳香叶CO2超临界提取物中的挥发性成分 如图2所示,艾纳香叶CO2超临界提取物中的挥发性成分主要包括:5种萜类衍生物(31.90%)、44种脂肪族化合物(18.58%)、10种芳香族化合物(18.50%)、12种含氮化合物(14.54%)及其他类成分。脂肪族化合物包括:13种酯类化合物,相对含量最高为5.51%;其他依次为17种饱和烷烃类(5.22%)、6种酮酸类(4.21%)、5种醇类(2.56%)、2种烯烃类(0.25%)、1种醚类(0.83%)。各组分中相对含量最高的为单萜酯类化合物1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-环戊烯(31.18%),其次为含氮化合物1-(4-十氢二苯并吡喃)-4-苯基-5-硫酮四唑(7.26%)、芳香族化合物邻苯二甲酸单丁酯(6.53%)、芳香族化合物1-对硝基乙酰苯-3,4-二甲氧基苯(3.61%)、酮酸类化合物2,6,6,9,9,13-六甲基-7,8-二氮-2,7,12-三烯-4,11-二酮-7,8-二氧化物(3.32%),这些成分占艾纳香叶挥发性成分总量的51.9%。

图2 艾纳香叶中挥发性成分的分类及相对含量

3 讨论

植物中的挥发性成分比较复杂,常常由几十种到数百种成分组成,大多为相对分子质量小、极性小的化合物,主要包括萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物等。本研究艾纳香叶CO2超临界提取物中的挥发性成分主要为萜类衍生物,占31.90%。萜类化合物是一类广泛存在于植物界的化学成分,具有多种生物活性,并且是一些中药的主要有效成分[30-32]。本研究发现了5种艾纳香中未曾报道过的萜类衍生物,其中包括含量最高的1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-环戊烯,占31.18%,有文献报道与其结构相近的倍半萜内酯具有抗流感病毒活性[33]。此外,还发现了种类丰富的饱和烷烃类化合物,包括正十九烷烃、正二十一烷烃、正二十八烷烃等活性成分,具有抗菌[34]、抗抑郁活性[35]。这些结果表明CO2超临界萃取得到的艾纳香叶提取物具有较高的开发前景。

本研究所得到的艾纳香叶CO2超临界提取物与文献报道的艾纳香挥发油成分有所不同:如王远辉等[27]采用GC-MS分析水蒸汽蒸馏法、同时蒸馏萃取法和顶空固相微萃取法3种方法提取的艾纳香提取物中含量较高的化学成分包括龙脑、樟脑、桉叶醇、花椒素、(+)-γ-古芸烯、(E)-罗勒烯、(E)-石竹烯等单萜及倍半萜类化合物,而本研究提取的艾纳香叶CO2超临界提取物并未发现这些成分,并且王远辉等提取的3个样品中相对含量前5位的化学成分在种类与数量上也都存在差异。这说明提取工艺会造成艾纳香提取物中化学成分的较大差异。与赵超等[15]的研究也有所不同,当超临界CO2萃取条件为萃取压力30 MPa,萃取温度50 ℃,萃取时间50 min时含量较高的化学成分有(+)-2-樟脑、L-龙脑、β-石竹烯、花椒油素、7-(2-羟基异丙基)-1,4α-二甲基十氢萘-1-醇、叶绿醇、二十四烷、三十三烷等,与本研究含量较高的1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-环戊烯、1-(4-十氢二苯并吡喃)-4-苯基-5-硫酮四唑、邻苯二甲酸单丁酯、1-对硝基乙酰苯-3,4-二甲氧基苯、2,6,6,9,9,13-六甲基-7,8-二氮-2,7,12-三烯-4,11-二酮-7,8-二氧化物等化学成分不同,说明萃取压力、萃取温度、萃取时间不仅对艾纳香挥发油的萃取率产生影响,提取物的化学成分也有差异。不同产地具有不同的自然环境和气候条件,可能影响中药化学成分的组成。因此,以上不同艾纳香提取物中化学成分的差异可能是由于样品的采摘地点、采摘季节及样品的提取工艺等因素所导致的。

此外,文献报道1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-环戊烯结构类似物具有抗流感病毒活性,而1,2-二甲基-1-甲酸乙酯-2-环戊烯在艾纳香叶CO2超临界提取物中的相对含量高达31%,这也为艾纳香药材资源的开发利用提供了新的思路。