β-内酰胺类及氟喹诺酮类抗生素对铜绿假单胞菌的防耐药突变浓度研究

唐婷,高鑫,李玟,陈奇娜,刘雪莉,庄杰蓉,马旭东,肖捷,余巍

铜绿假单胞菌是院内感染常见的致病菌,近年来随着临床广谱抗菌药物的大量长期使用,细菌的耐药性不断增强,多重耐药(MDR)和泛耐药(XDR)铜绿假单胞菌检出不断增多[1-2]。传统抗菌药物治疗细菌感染性疾病是基于最低抑菌浓度(MIC)理论,但由于MIC治疗策略仅是抑制或杀死大多数敏感菌,而少数耐药突变株会出现选择性富集扩增,导致治疗失败[3]。故单奇等[4]提出了防耐药突变浓度(MPC)和突变选择窗(MSW)的概念,MPC是防止一步耐药突变体富集扩增的最低浓度,当抗菌药物浓度达到或超过MPC时,可抑制耐药突变体的富集扩增,MSW是指MIC和MPC之间的浓度范围[5-6]。而MPC与MIC之间的比值被称为选择指数(SI),SI用于比较不同药物限制耐药菌株产生的能力,SI越小说明MSW的跨度越小,即药物限制耐药菌株产生的能力越强。本研究选择4种临床上治疗铜绿假单胞菌常用抗菌药物[美罗培南(MEM)、头孢他啶(CAZ)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)]在体外测定单药应用时的MIC、最小杀菌浓度(MBC)、MPC、SI,从而评估MEM、CAZ、CIP、LEV是否对铜绿假单胞菌存在的潜在耐药性,考察其防突变能力,旨在为临床合理使用抗菌药物提供相应的理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株及试剂来源 收集中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院临床分离的铜绿假单胞菌菌株,共5株(172、307、195、129、319)。铜绿假单胞菌CMCC(B)10104购自广东环凯微生物科技有限公司。MH琼脂培养基、M-H肉汤培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司,注射用美罗培南购自深圳市海滨制药有限公司,注射用头孢他啶购自国药集团致君(深圳)制药有限公司,乳酸环丙沙星氯化钠注射液购自山东齐都药业有限公司,盐酸左氧氟沙星购自扬子江药业集团有限公司。

1.2 MIC的测定 药敏试验采用微量肉汤稀释法[7],测定MEM、CAZ、CIP、LEV单独使用时的MIC,实验均设置阴性对照和阳性对照。确定MIC后,将MIC孔前3～5孔的液体培养基用无菌接种环接种于M-H琼脂平板培养基上,置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。采用活菌计数法检查琼脂平板上的菌落数,平均数<5个的药物浓度则为该药物对铜绿假单胞菌的MBC。

1.3 MPC的测定

1.3.1 含单药琼脂平板的配置:采用该琼脂平板稀释法[8]测定4种抗菌药物分别对质控菌株铜绿假单胞菌CMCC(B)10104和5株铜绿假单胞菌临床分离株的MPC。MEM、CAZ、CIP、LEV的药物浓度为各菌株的256 MIC、128 MIC、64 MIC、32 MIC、16 MIC、8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC,每个浓度制作4个平板。

1.3.2 菌悬液制备:从新鲜过夜培养的细菌平板上挑取菌落悬浮于生理盐水中,调整菌液浓度富集至3×108CFU/ml。

1.3.3 MPC测定:取3×108CFU/ml的菌液100 μl均匀涂布于含不同浓度药物的MH平板上,每个浓度4个平板,置37 ℃培养72 h,以4个平板均无细菌生长的最低药物浓度为MPC。再计算SI,SI=MPC/MIC。

2 结 果

MEM、CAZ、CIP、LEV单药对铜绿假单胞菌的MIC值分别为0.20～12.5 μg/ml、0.50～12.50 μg/ml、0.20～31.25 μg/ml、0.39～62.50 μg/ml;MBC值分别为0.39～25.00 μg/ml、0.50～25.00 μg/ml、0.40～31.25 μg/ml、0.39～125.00 μg/ml,见表1。根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)2012年标准判读结果可得,MEM、CAZ、CIP、LEV对铜绿假单胞菌临床分离菌株的耐药率分别为20%、80%、20%、20%;中介率分别为60%、20%、0、0;敏感率分别为20%、0、80%、80%(MEM:≤2 μg/ml为敏感,2～8 μg/ml为中介,≥8 μg/ml为抵抗;CAZ:≤8 μg/ml为敏感,8～32 μg/ml为中介,≥32 μg/ml为抵抗;CIP:≤1 μg/ml为敏感,1～4 μg/ml为中介,≥4 μg/ml为抵抗;LEV:≤2 μg/ml为敏感,2～8 μg/ml为中介,≥8 μg/ml为抵抗)。4种抗菌药物对6株铜绿假单胞菌菌株的MIC50、MIC90见表2。4种抗菌药物对铜绿假单胞菌CMCC(B)10104和5株临床分离株的MPC、MPC50及MPC90见表3、表4。4种抗菌药物对6株铜绿假单胞菌菌株的SI值见表5,可见LEV和CIP的SI值相较于MEM和CAZ小,SI越小MSW越窄,耐药突变体富集扩增的机会越小,越不容易选择出耐药突变菌,故LEV和CIP的预防耐药突变株出现的能力较强,MEM和CAZ相对较弱。实验过程中4种抗菌药物对铜绿假单胞菌标准菌株CMCC(B)10104的MIC值均在质控范围内。

表1 抗菌药物对铜绿假单胞菌CMCC(B)10104和5株临床分离株的MIC、MBC (μg/ml)

表2 抗菌药物对铜绿假单胞菌菌株CMCC(B)10104和5株临床分离株的MIC50、MIC90 (μg/ml)

表3 抗菌药物对铜绿假单胞菌CMCC(B)10104和5株临床分离株的MPC (μg/ml)

表4 抗菌药物对铜绿假单胞菌菌株CMCC(B)10104和5株临床分离株的MPC50、MPC90 (μg/ml)

表5 抗菌药物对铜绿假单胞菌CMCC(B)10104和5株临床分离株的SI

3 讨 论

本研究通过测定4种抗菌药物对临床分离铜绿假单胞菌菌株的MIC值与MPC值,可间接地推断不同抗菌药物对铜绿假单胞菌的MSW和SI,SI可以反映选择范围大小,指数越小,防耐药突变能力越强[9],进而评估4种抗菌药物单独使用条件下的潜在耐药性,关于该4种药物MPC的报道屡见不鲜,但其对临床铜绿假单胞菌分离株的研究报道很少。该研究通过体外测定不同抗菌药物对铜绿假单胞菌临床分离株的抗菌活性指标,具有一定的参考意义。可以看出,院内铜绿假单胞菌临床分离株对MEM、CAZ、CIP、LEV均表现出不同程度的耐药及不同程度的防突变能力,MEM的MIC值和MBC值各为0.20～12.50 μg/ml,0.39～25.00 μg/ml;CAZ的MIC值和MBC值各为0.50～12.50 μg/ml,0.50～25.00 μg/ml;CIP的MIC值和MBC值各为0.20～31.25 μg/ml,0.40～31.25 μg/ml;LEV的MIC值和MBC值各为0.39～62.50 μg/ml,0.39～125.00 μg/ml;MEM、CAZ、CIP、LEV抗铜绿假单胞菌菌株的MIC50值各为1.10 μg/ml、1.16 μg/ml、1.60 μg/ml、5.11 μg/ml;MIC90值各为11.52 μg/ml、4.29 μg/ml、17.16 μg/ml、98.43 μg/ml。MPC值范围各为2.50～40.00 μg/ml,3.19～50.00 μg/ml,0.63～100.00 μg/ml,0.63～100.00 μg/ml;MPC50值各为12.69 μg/ml、11.31 μg/ml、3.29 μg/ml、8.19 μg/ml;MPC90值各为71.58 μg/ml、45.87 μg/ml、30.15 μg/ml、157.04 μg/ml,进而得出各自的SI,其范围为3.18～25.64 μg/ml,3.20～25.42 μg/ml,1.59～3.20 μg/ml,1.60 μg/ml。LEV的防耐药突变能力是4个药物中最强的,其余3个需要较高浓度才能达到防耐药突变的作用。从实验结果来看,铜绿假单胞菌临床分离株对喹诺酮类抗菌药物的耐药率高达80%,但其两者防耐药突变能力是相对较强的;对MEM和CAZ的耐药率分别为20%和0,防耐药突变能力是相对较弱的,即MPC与MIC存在不一致性,其与聂大平等[10]研究相符,原因可能是细菌含有的突变亚群对抗生素敏感性及突变程度的范围是非常广泛的,可能含有许多不同的突变体[11]。总体上来说,4种抗生素对抗铜绿假单胞菌均存在不同程度的潜在耐药性,故不宜单独使用,提示临床应加强监测MEM、CAZ、CIP、LEV对铜绿假单胞菌的敏感性及疗效,后续实验可扩大样本量对实验结果展开进一步的证实。随着临床对β内酰胺类抗生素及喹诺酮类抗生素的广泛应用,其相应的耐药菌株已逐渐被检出并呈现递增趋势,这是值得临床关注的。本研究通过对院内分离的铜绿假单胞菌菌株的耐药性研究,从而根据抗菌药物的特点制定合理的给药方案,促进抗菌药物的合理使用,延缓耐药进程。

同样的,MPC和MSW理论还有许多尚未解决的问题,因此如何限制和缩小MSW以及联合用药预防耐药的机制可能是今后的研究方向[12]。在未来,希望通过研究新一代抗菌药物,缩短血浆抗菌药物浓度在MSW的时间,减少MPC和MIC的浓度差距,以期利用联合用药达到缩小或关闭MSW[13]。

当然,本研究存在有一定的不足之处,首先仅收集院内铜绿假单胞菌临床分离株,菌株来源单一且本研究纳入的试验菌株相对较少,结果存在一定的偏倚性。对于近几年更多学者研究的相较于最低抑菌浓度更热门的防耐药突变浓度,后续可进一步测定将不同种类的抗菌药物联合应用相较于单药应用时对抗铜绿假单胞菌的浓度下降的情况,进而得出联合用药对MSW和SI产生的影响,因为若为了达到治疗效果而增大给药剂量是弊大于利的,会导致严重的不良反应,故可从联合用药的角度,使MSW变窄,让耐药细菌产生的可能性越小。最后,本研究仅是体外试验,由于人体环境复杂、对药物的影响因素多,体内的药物质量浓度不恒定,不能真实反映出体内杀菌效果和细菌变异情况,后续可结合相应的药效学参数Cmax或AUC对抗菌药物进行判断。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。