畜禽粪便和土壤中典型抗生素SPE-UPLC-MS/MS检测方法的建立

摘 要：应用固相萃取-超高效液相色谱串联质谱（solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry， SPE-UPLC-MS/MS）技术，建立了同时测定畜禽粪便和土壤中磺胺类（sulfonamides， SAs）、喹诺酮类（quinolones， QNs）及大环内酯类（macrolides， MACs）等22种兽用抗生素残留的分析方法。样品经McIlvaine-EDTA-2Na缓冲液和乙腈-甲醇 （体积比1∶1）溶液提取，Oasis HLB固相萃取柱净化，电喷雾正电离源（positive electron spray ionization， ESI+）和多反应监测（multiple reaction monitoring， MRM）进行检测，外标法定量。研究结果表明：22种抗生素的浓度在0.005～0.5μg·mL^-1时具有良好的线性关系;平均回收率为61.4％～93.3％，相对标准偏差为2.62％～13.8％;检出限为0.1～1.1μg·kg^-1，定量限为0.3～3.6μg·kg^-1。该方法可同时实现畜禽粪便和土壤中22种抗生素的准确定性、定量分析。

关 键 词：抗生素; 超高效液相色谱-串联质谱; 畜禽粪便; 固相萃取

中图分类号：S141;X502 文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1673-5862.2023.02.004

Establishment the method of SPE-UPLC-MS/MS for detecting common antibiotics in livestock manures and soil aquatic environment

LIU Yu^1，2， WANG Yonggang³， LYU Hongying²， LI Jie¹， FU Haibin²， HAN Xiaohu¹， JIANG Feng¹， WANG Haiyan⁴， JIANG Li³， ZHANG Min¹

（1. College of Engineering， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China; 2. Technology Center of Shenyang Customs， Shenyang 110016， China; 3. Shenyang Customs， Shenyang 110179， China; 4. Technology Center of Hohhot Customs， Hohhot 010020， China）

Abstract：A method for the analysis of 22 verterinaryantibiotics residue including sulfonamides（SAs），quinolones（QNs） and macrolides（MACs） in livestock manures was developed based on solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（SPE-OPLC-MS/MS）. Samples were extracted with McIlvaine-EDTA-2Na buffer and methanol-acetonitrile（1∶1，V/V） solution. Extraction liquid was purified by an Oasis HLB SPE column. Quantitative analysis was performed using multiple reaction monitoring mode（MRM）. External standard method was adopted as the quantitative method. The calibration curves show good linearity within the concentrations of 0.005～0.5μg·mL^-1. The averaged recoveries of 22 verterinaryantibiotics are ranged from 61.4% to 93.3%. The relative standard deviations are both less than 2.62%～13.8%.The detected limits （LOD） are 0.1～1.1μg·kg^-1， limit of quantification （ LOQ） are 0.3～3.6μg·kg^-1. This method can achieve simultaneously and accurate qualitative and quantitative analysis of 22 kinds of antibiotics in livestock manure and soil by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Key words：antibiotics; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; livestock manures; solid phase extraction

基于预防疾病和促进生长的目的，兽用抗生素被广泛应用于畜禽养殖业中^［1-2］，由于兽用抗生素不能完全被动物体吸收，约30%～90%的抗生素将随着畜禽粪便排泄出来^［3-4］。目前，我国兽用抗生素年均消费已达6000t^［5］，畜禽粪便及其养殖场周边环境中的兽用抗生素污染已经达到较为严重的程度，有学者调查研究发现，广东、北京、江苏、内蒙古、天津、福建、浙江等地区土壤及畜禽粪便中抗生素残留均有不同程度的检出，有些地区抗生素残留已达到了mg·kg^-1级^［6-9］。畜禽粪便中残留的过量抗生素通过施肥进入环境中，对农田土壤、地表和地下水及生态系统中各类生物产生危害，并诱发和传播各类抗生素耐药细菌，严重影响生态环境和人类健康^［10-12］。

对畜禽粪便、土壤等环境基质中的兽药残留进行监测的一个重要手段就是建立能够快速、准确地进行残留物检测的方法。液相色谱法是一种较为常用的方法^［13-15］，但其前处理比较复杂，由于土壤和畜禽粪便基质复杂，检测分析时会受到较大干扰，因而需建立有效的前处理方法以减少干扰^［14］。超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）具有检测范围宽、灵敏度高、抗干扰能力强等特点^［16-25］，正逐步用于环境基质中抗生素的检测。为此，针对现有抗生素检测方法主要针对畜禽产品，而畜禽粪便和土壤基质中有多种抗生素残留且检测方法研究较少的现状，本研究运用UPLC-MS/MS技术，建立了同时测定土壤和畜禽粪便中磺胺类、喹诺酮和大环内酯类的22种兽用抗生素残留的分析方法，该方法灵敏度高、准确度高、重现性好，可用于土壤和粪便中抗生素残留监测并为抗生素污染治理提供技术保证。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：液相色谱串联质谱仪（美国Waters公司）;固相萃取装置（美国Supelco公司）;固相萃取柱（美国Waters公司）;Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）;BSA822电子分析天平（德国Sarturius公司）;Z323K高速离心机（德国Hermle公司）;XW-80A旋涡混合仪（上海楚定分析仪器）;MG-2200氮吹仪（日本EYELA公司）。

试剂：甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯;柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠均为分析纯;实验用水均为超纯水。

标准品：磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathiazole，STZ）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SMR）、磺胺二甲嘧啶（sulfadimidine，SM2）、磺胺氯哒嗪（sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺甲噁唑（sulphamethoxazole，SMX）、磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺异噁唑（sulfafurazole，SFZ）、磺胺苯甲酰（sulfabenzamide，SBZ）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazolum，SPZ）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，SQ）、恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、诺氟沙星（norfloxacin，NOR）、噁喹酸（oxollinic acid，OA）、氟甲喹（flumequene，FLU）、林可霉素（lincomycin，LI）、螺旋霉素（spiramycin，SP）、吉它霉素（kitasamycin，KI）、泰乐菌素（tylosin，TYL）、克林霉素（clindamycin，CL），所有化学标准品购自德国Dr. Ehrenstorfer（纯度均≥96%）。

标准溶液的配制：分别精确称取10mg的标准品（精确到0.0001g）于10mL容量瓶中，用甲醇稀释溶解，配制成1g·L^-1的标准储备液，4℃冰箱内密封、避光保存。

McIlvaine-EDTA-2Na缓冲液配置：将1L的0.1mol·L^-1的柠檬酸溶液和625mL的0.2mol·L^-1的磷酸氢二钠混匀，并加入60.5g的EDTA-2Na溶解后混合均匀，用0.3mol·L^-1的NaOH溶液调节pH至4.0左右^［15-16］。

1.2 样品提取与净化

畜禽粪便样品：采集新鲜畜禽猪粪避光密封，于2h内带回实验室在-18℃保存，样品经冷冻干燥粉碎研磨，过60目筛。称取1g（精确至0.01g）样品置于50mL具塞离心管中，先加入5mL McIlvaine-EDTA-2Na缓冲液，震荡混匀后再加入10mL甲醇-乙腈 （1∶1，V/V）提取液，常温超声20min后，振荡30min，5000r·min^-1离心15min，收集上清液。再分别用McIlvaine-EDTA-2Na缓冲液和甲醇-乙腈（1∶1，V/V）提取液重复提取2次，合并3次提取液，40℃水浴旋转蒸发浓缩至10mL左右，取5mL浓缩液，用超纯水稀释至10mL，过0.45μm纤维滤膜后，进行固相萃取。

土壤样品：土样采自沈阳农业大学玉米试验田0～20cm 的表层土壤。自然风干，研磨干燥土样，过60目筛，备用。称取1g（精确至0.01g）样品置于50mL具塞离心管中，其余处理过程与上述畜禽粪便处理方法相同。

依次用5.0mL甲醇及10.0mL超纯水活化Oasis HLB SPE萃取柱（Waters，500mg/6mL），上样后，用5mL超纯水淋洗萃取柱并抽干，再用10.0mL甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃条件下氮气吹干后，1mL 20%甲醇定容，过0.22μm的微孔滤膜，待测定。

1.3 检测条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C₁₈柱（100mm×2.1mm，1.7μm）。流动相：A为0.2％甲酸，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～2min，5%B;2～8min，5%～25%B;8～14min，25%～42%B;14～30min，42%～95%B;30～32min，95%B;32～35min，5%B。柱温：40℃。流速：0.2mL·min^-1。进样体积：10μL。

1.3.2 质谱条件

电离方式为ESI+;电离电压为3.0kV;离子源温度为100℃;脱溶剂温度为300℃;脱溶剂气流量为500L·h^-1;锥孔反吹气流量为50L·h^-1;采集方式为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取条件的优化

本实验采用固相萃取净化技术对畜禽粪便样品提取液进行净化，分别考察了Oasis HLB（500mg/6mL），C18 （500mg/6mL），Oasis MCX（500mg/6mL） 3种固相萃取柱对猪粪样品中8种抗生素的净化效果，实验结果见表1。结果表明，采用Oasis HLB固相萃取柱净化后含抗生素的样品回收率较高。HLB固相萃取填料的主要成分是二乙烯苯和亲水性的N-乙烯基吡咯烷酮2种单体按照一定比例聚合而成的大孔聚合物， 吸附量较大， 适合于大多数有机化合物的提取， 重现性和稳定性也较好。

实验也考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯的洗脱效果，结果表明甲醇作为洗脱液时多种抗生素均具有较好的回收率。同时，当甲醇的用量为10mL时，洗脱液对目标抗生素洗脱完全，且洗脱速度为1.0mL·min^-1时洗脱效果较好。

2.2 色谱条件的优化

为提高目标物正离子化效率，以甲醇-0.2%甲酸为流动相，采用梯度淋洗的方式，优化了色谱流动相梯度。

2.3 质谱条件的优化

实验采用三通方式，在ESI+模式下分别对0.1mg·L^-1的22种抗生素单标标准工作液进行一级质谱全扫描分析，确定分子离子峰，二级质谱以分子离子为母离子，选择定量和定性2个子离子，同时优化锥孔电压和碰撞能量，最终确定质谱参数，结果见表2。

2.4 线性范围和方法检出限

用空白基质溶液制备浓度分别为0.005，0.02，0.05，0.2，0.5μg·mL^-1的各抗生素混合基质标准溶液，依照上述2.3质谱条件进行检测分析，绘制22种抗生素的标准曲线，22种抗生素的线性回归方程、相关系数、检出限（limit of detection， LOD）（S/N=3）、定量限（limit of quantitation， LOQ）（S/N=10）见表3。从表3中可以看出，22种抗生素的检出限为0.1～1.1μg·kg^-1，定量限为0.3～3.6μg·kg^-1，22种抗生素浓度为0.005～0.500μg·mL^-1时线性良好，相关系数（r）为0.9979～0.9997，满足检测的技术要求。

2.5 方法的回收率和精密度

在1g空白土壤、畜禽粪便样品中分别添加22种抗生素混合标准溶液做加标回收实验，添加浓度水平分别为0.02，0.05，0.5mg·kg^-1，每个样品重复测定6次，考察方法的准确度和精密度，其回收率和相对标准偏差见表3。结果显示，在3个加标水平上22种抗生素的平均回收率在61.4%～93.3%，相对标准偏差为2.62%～13.8%。由此可见，该方法的回收率和精密度满足检测技术要求。

3 结 论

本文建立了土壤和畜禽粪便中磺胺类、喹诺酮和大环内酯类等22种抗生素的固相萃取-超高效液相色谱串联质谱测定方法，可同时实现22种典型抗生素的定性、定量分析。采用SPE技术可有效去除粪便、土壤等复杂样品中的杂质，方法简单快速，灵敏度高，重现性好，满足实验分析要求，可用于土壤和畜禽粪便中磺胺类、喹诺酮和大环内酯类药物残留的同时测定，为土壤和畜禽粪便中抗生素残留监控提供技术支持。

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