水稻恶苗病拮抗细菌的筛选及生防机制

摘 要：从稻蟹生态种养水稻根际土壤中分离得到3株对水稻恶苗病具有防治作用的拮抗细菌，其防治效果可分别达到69%，60%，62%。经鉴定，3株拮抗细菌分别为解淀粉芽孢杆菌J2（Bacillus amyloliquefaciens）、芽孢杆菌属J3（Bacillus sp.）和枯草芽孢杆菌F3（Bacillus subtilis）。3株拮抗细菌均可代谢产生蛋白酶与纤维素分解酶，致使病原菌菌丝顶端部分膨大，从而抑制菌丝生长，降低恶苗病发病率。拮抗细菌也可同时促进水稻苗期光合作用和生物量的增加，诱导水稻超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性提高，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量下降，进而提高水稻防御能力，降低病害发生。3株拮抗细菌均表现出对水稻恶苗病良好的防治效果，且对水稻生长产生积极影响，具有一定的开发潜力。

关 键 词：藤仓镰刀菌; 拮抗细菌; 生防机制

中图分类号：S158.5 文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1673-5862.2023.02.016

Screening of antagonistic bacteria against Fusarium fujikuroi in rice and biocontrol mechanism

TONG Deli¹， LIU Jinghua¹， YU Xin¹， ZHU Guangpeng¹， LI Mengqi¹， HE Haisheng²

（1. College of Life Science， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China;

2. Experimental Teaching Center， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China）

Abstract：Three antagonistic bacteria against Fusarium fujikuroi were isolated from rice rhizosphere soil cultivated by rice-crab ecological culture. They were identified as Bacillus amyloliquefaciens J2， Bacillus sp. J3 and Bacillus subtilis F3. All of them had good control effect on rice seedling malignant seedling disease， and the control effect reached 69%， 60% and 62%， respectively. All the three antagonistic bacteria could produce proteases and cellulolytic enzymes， which caused the apical part of the mycelium to expand， thus inhibiting the growth of mycelium and reducing the incidence of malignant seedling disease. Antagonistic bacteria could promote the photosynthesis and biomass of rice at seedling stage， induce the activities of superoxidedismutase （SOD）， peroxidase （POD） and catalase （CAT） in rice and decrease the activity of malondialdehyde （MDA）， thereby improving the defense ability of rice and reducing the occurrence of rice diseases. All the three antagonistic bacteria showed good control effect on rice malignant seedling disease， and had a positive effect on rice growth， which had certain development potential.

Key words：Fusarium fujikuroi; antagonistic bacteria; biocontrol mechanism

水稻作为我国第一大粮食作物，其种植与产量关乎国家粮食安全^［1］。然而，水稻病害的发生严重影响水稻的品质与产量，常见的水稻真菌病害包括水稻基腐病、纹枯病、恶苗病、稻瘟病、白叶枯病等^［2-6］。其中，水稻恶苗病在中国稻区分布广泛，该病主要由藤仓镰刀菌（Fusarium fujikuroi）和层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）引起，二者分布最广、致病力最强^［7］。水稻恶苗病在水稻苗期的症状包括徒长、叶片细长呈淡绿色、矮化、死苗等，在成株期引起根部和茎基部腐烂，严重时整株枯死^［8］，该病爆发后，一般造成水稻减产10%～20%，严重时高达50%^［9-10］。

目前，控制水稻真菌病害主要以化学杀菌剂为主，但其具有潜在的环境风险，因而生物防治已经成为控制植物病害的理想方法^［11-12］。学者已经筛选出对植物霜霉病^［13-16］、黄瓜灰霉病^［17］、番茄灰霉病^［18-19］、水稻基腐病^［2］、水稻纹枯病^［3］、水稻稻瘟病^［5］、水稻白叶枯病^［6］等植物病害具有较好效果的拮抗微生物，但对水稻恶苗病的生物防治的报道较少。本研究以稻蟹生态种养田块中水稻根际土壤细菌为材料，旨在筛选对水稻恶苗病具有防治作用的拮抗菌株，并研究其防治效果和对水稻生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

土壤样品采自辽宁省盘山县稻蟹共作田水稻根际，水稻恶苗病病原菌为藤仓镰刀菌（Fusarium fujikuroi），由沈阳师范大学微生物学实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 拮抗细菌的分离、筛选与鉴定

拮抗细菌的分离采用稀释平板法获得细菌纯培养^［20］。采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar medium，PDA）平板对峙法筛选拮抗细菌，在平板采取2点对峙，一端接种1cm藤仓镰刀菌菌饼，将已分离纯化的拮抗菌株分别点接在距离指示菌3cm处的点上，以不接拮抗菌株为对照，置于25℃恒温培养，每个处理重复3次。待对照菌株长满整个培养皿，测定菌丝生长距离，计算抑菌率^［20］：

菌株鉴定结合《常见细菌系统鉴定手册》^［21］与分子测序方法^［22］，测序由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。

1.2.2 拮抗细菌对水稻苗期恶苗病的影响

稻种经消毒、催芽后，每盆种植50粒水稻种子，25℃光照培养箱中培养，采用剪叶喷雾接种法，于两叶一心期对水稻叶鞘部位进行微伤口处理，对照接种恶苗病菌和无菌水，以CK表示;同时接种恶苗病菌和J2，J3，F3，菌悬液的处理以T1，T2，T3表示，每天早晚各接种一次，直至不流液，每个处理重复3次，连续接种15d后，调查水稻恶苗病的发病率^［23-24］。

1.2.3 拮抗细菌无菌发酵液对水稻恶苗病菌丝生长的影响

在9mL酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium， YEPD）培养基中加入1mL病原菌孢子悬浮液，150r·min^-1，25℃条件下摇瓶培养12h以获得菌丝体。之后按照10%的终浓度加入菌株无菌发酵液，摇瓶培养24h后对藤仓镰刀菌的菌丝形态进行显微观察，以不加菌株无菌发酵液为对照^［25］。

1.2.4 拮抗细菌相关代谢酶活性

参照关小敏^［20］的方法测定拮抗细菌蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和几丁质酶活性。

1.2.5 拮抗细菌对水稻幼苗生长的影响

完成1.2.2实验的同时，CK，T1，T2和T3各处理随机选取3株水稻幼苗进行株高、叶绿素含量和相关酶的测定。利用SPAD-502 Plus型叶绿素计测定叶片叶绿素含量，测定时选取不同叶片的相同位置;利用可见分光光度法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量;愈创木酚比色法测定过氧化物酶（POD）活性;紫外比色法测定过氧化氢酶（CAT）活性。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的筛选鉴定

2.1.1 拮抗细菌对水稻恶苗病的拮抗效果

从水稻根际土壤中初筛得到具有恶苗病菌拮抗能力的细菌24株，经过反复筛选，最终获得3株具有稳定拮抗能力的菌株，将其分别编号为J2，J3，F3。由表1可见，3株拮抗细菌的抑菌率基本在50%以上。其中，J2的拮抗效果显著高于其他菌株（Plt;0.05），抑菌率达到了60%，J3和F3的抑菌率分别为48%和52%。

2.1.2 形态学及生理生化鉴定

3株拮抗细菌在营养琼脂培养基（potato dextrose agar medium，NA）中培养24h， 菌落均呈乳白色、近圆形凸起，前期表面光滑、边缘整齐、不透明、易挑取。菌体均呈杆状，J2细胞大小（0.4～0.8）×（0.6～1.0）μm，J3细胞大小（0.6～0.8）×（0.6～1.0）μm，F3细胞大小（0.6～1.0）×（0.6～1.2）μm，革兰氏染色均为阳性。3株拮抗细菌的部分生理生化特性见表2。其中，J2和J3硝酸盐还原试验、吲哚试验、硫化氢试验为阳性;明胶液化试验、淀粉水解试验为阴性;F3硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验为阳性;硫化氢试验、淀粉水解试验为阴性。

2.1.3 分子生物学鉴定

如图1所示，3株拮抗细菌16S rD NA序列通过NCBI的Blast程序与数据库中的16S rDNA 序列进行比对，J2与解淀粉芽孢杆菌属16S rDNA序列的相似性高达99％，初步确定其为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）;J3与芽孢杆菌16S rD NA序列的相似性高达99％，初步确定其为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）;F3与枯草芽孢杆菌属16S rDNA序列的相似性高达99％，初步确定其为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.2 拮抗细菌对水稻恶苗病的防治效果

表3所示水稻盆栽结果表明，对于只接种恶苗病菌处理，水稻叶片呈淡黄绿色且叶鞘黄色，发病指数为99%;与单加病原菌处理相比，接种拮抗细菌处理J2，J3，F3后，水稻发病率显著降低（Plt;0.05），水稻叶片与叶鞘大部分为绿色，小部分发病为黄绿色，发病指数分别为31%，40%，38%，平均相对防效分别高达69%，60%，62％，但J3和F3之间差异并不显著（Pgt;0.05），二者与J2差异显著（Plt;0.05），表明3株拮抗细菌对水稻恶苗病防治效果较好。

2.3 拮抗细菌生防机制

2.3.1 拮抗细菌无菌发酵液对水稻恶苗病菌丝生长的影响

由图2可知，摇瓶培养24h后，病原菌菌丝表面光滑、圆润，生长正常。添加10%发酵液后，各处理菌丝顶部均呈现部分膨大，生长出现异常，可能与拮抗细菌在生长过程中产生的代谢酶或者某些抗菌类的物质相关^［26-27］。

2.3.2 拮抗细菌代谢酶检测

由表4可知，3株拮抗细菌蛋白酶、纤维素酶试验均为阳性，蛋白酶产酶圈直径分别为2，1.8，2.2cm，纤维素酶产酶圈直径分别为2.5，1.6，1.7cm，表明3株拮抗细菌均能产生蛋白酶和纤维素酶，对蛋白和纤维素具有分解作用。然而，3株拮抗细菌果胶酶和几丁质酶试验均为阴性，表明均未能产生相应酶降解果胶和几丁质。

2.4 拮抗细菌对水稻幼苗生长的影响

2.4.1 拮抗细菌对水稻株高和叶绿素含量的影响

由图3所示，与单加恶苗病菌处理相比，接种拮抗细菌J2，J3，F3后，水稻株高和叶绿素含量均显著提高（Plt;0.05）。其中，水稻株高分别提高30.52%，32.25%和27.16%，但三者之间差异并不显著（Pgt;0.05）;叶绿素含量分别提高15.7%，12.13%和9.62%，且三者之间差异显著（Plt;0.05）。接种3株拮抗细菌对水稻幼苗生长、叶绿素合成有明显的促进作用，水稻可以更好地进行光合作用。

2.4.2 拮抗细菌对水稻幼苗抗氧化酶活性和MDA含量的影响

由图4 可知，接种拮抗细菌J2，J3，F3后，水稻幼苗根和叶SOD，POD，CAT活性均显著提高，MDA含量显著下降（Plt;0.05）。其中，水稻根部SOD活性分别提高44.45%，22.22%和35.09%，但J2和F3之间差异并不显著（Pgt;0.05）;POD酶活性分别提高77.19%，63.03%和63.03%，但J3和F3之间差异并不显著（Pgt;0.05）;CAT酶活性分别提高45.75%，49.13%和9.55%，但J2和J3之间差异并不显著（Pgt;0.05）;MDA含量分别降低18.47%，20.05%和17.83%，且J3和F3之间差异显著（Plt;0.05）。水稻叶片SOD酶活性分别提高60.51%， 61.94%和44.03%，但J2和J3之间差异并不显著（Pgt;0.05）;POD酶活性分别提高90.70%，124.65%和89.40%，但J2和F3之间差异并不显著（Pgt;0.05）;CAT酶活性分别提高75.01%，142.42%和75.01%，且三者之间差异显著（Plt;0.05）;MDA含量分别降低47.35%，53.59%和52.41%，但J3和F3之间差异不显著（Pgt;0.05）。

SOD是细胞防御系统中的第一道防线，能维持机体内氧自由基的动态平衡，可减轻氧自由基对细胞造成的伤害，在细胞代谢过程中具有极其重要的地位。CAT也是清除细胞内过氧化氢含量的主要酶，常与SOD联合清除细胞内活性氧自由基，然后POD将SOD歧化产生的H₂O₂分解，三者协同作用，在细胞防御系统中发挥着尤为重要的作用^［28-29］。水稻幼苗经拮抗细菌处理后，SOD，POD和CAT活性显著提高，MDA活性下降，表明加入拮抗细菌可以有效清除氧自由基，阻碍脂质过氧化物MDA产生，提高水稻自身防御能力，降低病害发生。

3 讨 论

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）广泛应用于农业、食品、医药等行业^［5，30］。解淀粉芽孢杆菌对金银花白粉病、甘蔗鞭孢堆黑粉病、稻梨孢菌、番茄灰霉病具有良好的防治作用^［31］，枯草芽孢杆菌对水稻稻瘟病^［5］、纹枯病^［32］、黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病^［33］等植物真菌病害有不同程度的防治效果，本研究也获得了类似的结果，表明芽孢杆菌属的细菌对植物真菌病害具有良好的防治潜能。解淀粉芽孢杆菌可同时产生脂肽类和蛋白类活性物质，可以有效抑制孢子萌发、胞内物质外泄等^［31］。类芽孢杆菌能够产生纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等，这些酶能够导致病原菌菌丝发生畸形，如菌丝顶端膨大、菌丝变短、弯曲、缠绕等^［20］。本研究发现3株拮抗细菌均对蛋白、纤维素有分解作用，说明这些酶可以降解病原菌菌丝体细胞，导致菌丝发生熔断畸变，抑制菌丝生长。枯草芽孢杆菌常作为有益菌剂用于农业生产，可有效促进小麦、向日葵、水稻等作物的生长^［34-36］。本研究亦发现相似结果，解淀粉芽孢杆菌J2、芽孢杆菌属J3、枯草芽孢杆菌F3可显著降低水稻恶苗病的发病情况，防效分别高达69%，61.4%和63.4％，并能促进植株生长，株高分别提高30.52%，32.25%和27.16%。

在植物自身防御相关酶系中，POD，SOD，CAT具有协同作用，POD可以提高植物体内SOD和CAT清除自由基和分解H₂O₂为H₂O和O₂的能力，同时，还可以阻碍脂质过氧化物MDA的产生，防御酶的共同作用，使得植物能抵抗病害入侵和不良环境的影响^［25］。本研究中水稻幼苗经拮抗细菌处理后，SOD，POD和CAT活性显著提高，MDA活性下降，表明加入拮抗细菌可以提高水稻自身防御能力，降低病害发生，与张伟珍等^［37］的研究结果相一致。

4 结 论

从稻蟹生态种养水稻根际土壤中分离得到3株对藤仓镰刀菌具有防控作用的拮抗细菌，经鉴定分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），3株拮抗细菌均对水稻苗期恶苗病具有良好的防治效果，防效均在60%以上。3株拮抗细菌均可代谢产生蛋白酶与纤维素分解酶，并对病原菌菌丝产生不利影响，从而有效抑制病原菌生长，降低恶苗病发病率。此外，拮抗细菌还可以诱导水稻SOD，POD和CAT活性提高，MDA活性下降，从而提高水稻防御能力，降低病害发生率。

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